‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨HHT基因克隆与表达分析

吕照清,任丹丹,周　贺,乔玉山

(南京农业大学 园艺学院,南京 210095)



‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨HHT基因克隆与表达分析

吕照清,任丹丹,周贺,乔玉山*

(南京农业大学 园艺学院,南京 210095)

摘要:该试验以砂梨品种‘黄花’梨(果皮褐色)及其芽变‘绿黄花’梨(果皮绿色)盛花后第8周的果皮为试材，利用常规PCR和巢式PCR技术克隆了ω-羟基棕榈酸O-阿魏酰转移酶(ω-hydroxypalmitate O-feruloyl transferase, HHT)基因cDNA的全长，命名为 PpyHHT(登录号为KX131155)。序列分析结果表明，该基因开放阅读框(ORF)为1 335 bp，编码444个氨基酸。生物信息学分析显示，推定的PpyHHT蛋白质相对分子质量为49.91 kD，等电点是4.75，与白梨相似性高达98%，亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)表达分析显示，2种梨果皮中 PpyHHT基因在盛花后6～9周的4个转色关键期表达量不断变化，在‘黄花’梨果皮中的表达量明显高于‘绿黄花’梨。推测 PpyHHT基因可能参与砂梨果实褐色/绿色性状的形成。

关键词:砂梨； HHT基因；克隆；生物信息学；基因表达

砂梨(PyruspyrifoliaNakai)原产中国，其果皮呈褐色、绿色和红色等类型，且以褐色和绿色为主。红皮梨果实的色泽受花青素控制，而砂梨果实褐色/绿色的形成机理与红皮梨不同[1-2]。研究发现，砂梨果实的褐色是由于角质层和表皮细胞破损后木栓层的积累形成的[3-4]。

木栓层由木栓质片层结构组成，木栓质是由木栓聚酚结构域[suberin poly(phenolic) domain，SPPD]和木栓聚酯结构域[suberin poly(aliphatic) domain，SPAD]组成的大分子结构。SPPD主要是羟基阿魏酸及其衍生物共价连接而成，调控苯丙烷-阿魏酸途径的酶主要有：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、ω-羟基棕榈酸O-阿魏酰转移酶(HHT)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和肉桂酰CoA氧化还原酶(CCR)等[5-6]；SPAD主要由甘油、α,ω二羟基羧酸和长链脂肪酸等以酯键或醚键交联而成[6-8]，参与长链脂肪酸代谢的酶主要有：长链脂肪酸酰基CoA合成酶(LACS)、β-酮酰CoA合酶(KCS)、脂肪酸ω-羟化酶(FAωH)和CYP86A脂肪酸ω-羟基化酶等[9-12]。目前已克隆的梨木栓质合成相关基因有PAL、C4H和CCR等[13-15]。

ω-羟基棕榈酸O-阿魏酰转移酶(ω-hydroxypalmitiate O-feruloyl transferase, HHT)是苯丙烷生物合成途径中的关键酶，催化阿魏酰辅酶A生成ω-羟基棕榈酸和1-伯醇[16]，拟南芥HHT体外试验证实也会促进阿魏酰棕榈酸和烷基阿魏酸酯的形成[17]。HHT直接或间接影响阿魏酸及其衍生物的表达，从而影响SPAD和SPPD大分子的结构组成。本试验通过对‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨转录组数据的分析，发现HHT基因在‘黄花’及‘绿黄花’梨果实色泽形成关键期的表达量存在显著差异，因此本试验克隆了‘黄花’及‘绿黄花’梨果皮HHT基因，分析其在果实色泽形成关键期的表达情况，以期为探讨砂梨果皮褐色形成机理提供依据。

1材料和方法

1.1材料

以江苏省南京市溧水果园‘黄花’及其芽变‘绿黄花’梨盛花后第6、7、8、9周果实为试材，削取果皮，液氮速冻后-80 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1总RNA提取及HHT基因克隆采用改良CTAB法提取果皮总RNA[18]，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。取1 μg总RNA，利用PrimescriptTMreagent Kit with gDNA Eraser(中国TaKaRa公司生产)反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。根据NCBI上已登录的白梨(PyrusbretschneideriRehd.)HHT基因序列(XM_009379727)，利用Primer Premier 5设计1对特异引物，对‘黄花’梨及‘绿黄花’梨HHT基因片段进行PCR扩增，引物为HHT-F(5’-TCTCCTTTCCATTCGTCA-3’)和HHT-R(5’-AGCATCAGCAATCTCAGTG-3’)。PCR反应体系总体积为25 μL，包含模板1 μL，引物各0.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，ExTaqDNA聚合酶0.2 μL，用ddH2O补足。PCR扩增条件为94 ℃预变性5 min；94℃ 变性20 s，58 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖胶电泳检测。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(中国Axygen公司所生产)胶回收试剂盒对目的片段回收。与载体pMD19-T连接后转化DH5α感受态大肠杆菌细胞进行蓝白斑筛选。选取白色单菌落进行PCR检测，阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.2目的基因3’端序列克隆根据扩增产物的测序结果设计2条正向巢式特异引物3W(5’-ACTTGGTCTAAGCTGTCGTT-3’)和3N(5’-ACTGAGATTGCTGATGCTTT-3’)，反向引物为R16326(5’-GGTGGTAGAGCTCGCAGGACTGCAGCTGACTG-3’)和R16324(5’-AGAGCTCGCAGGACTGCAGCTGACTGACTAC-3’)，利用接头引物R11466(5’-GCAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VN-3’)以3 μg总RNA为模板合成第一链cDNA。PCR扩增采用巢式PCR策略，进行两轮PCR扩增。第一轮以cDNA为模板，以3W和R16326为上下游引物，第一轮PCR产物稀释10倍后作为第二轮PCR模板，以3N和R16324为上下游引物。第一轮/第二轮PCR程序：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 20 s，60/56 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 60 s，共35个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，经克隆后送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.3生物信息学分析借助Clustal X和Mega 5软件，对所得序列与GenBank中其他物种的HHT基因序列进行同源性分析，挑选典型物种进行多序列比对，Clustal X生成比对结果，利用Mega 5对比对结果构建系统发育树，进行系统发育分析。采用DNAMAN对PpyHHT基因翻译和氨基酸序列分析，在NCBI网站上进行Blast和保守结构域分析，Mega 5软件进行进化树的构建。

1.2.4PpyHHT基因定量PCR分析分别以盛花期后第6至第9周的梨果实总RNA，反转录得到的cDNA为模板，进行qRT-PCR反应。根据已克隆的PpyHHT基因序列设计1对特异引物CO-F(5’-TCTTGTTCCTTTCTAATGGG-3’)和CO-R(5’-GGGCTCTTTCACCCACTT-3’)。以砂梨Ubiqutin基因为内参基因，引物为CO138(5’-GCTCGCAGTGCTCCAGTTCTAC-3’)和CO139(5’-AACATAGGTCAACCCGCACTT-3’)。参照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)试剂盒(中国TaKaRa公司所生产)说明进行qRT-PCR反应。反应体系为10 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，0.3 μL上、下游引物，1 μL cDNA，ddH2O补足至20 μL。反应程序为95 ℃预变性4 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40个循环。实时荧光定量PCR试验使用ABI7300 cycler(美国)仪器完成，试验数据由2-ΔΔT公式计算处理，测定样本均设3个重复。

ATG. 起始密码子；TAG. 终止密码子；阴影. 保守结构序列图1　PpyHHT基因的核苷酸序列及氨基酸序列ATG. Start codon; TAG. Stop codon; Shadow. Conserved domain sequenceFig. 1　The nucleotide acid sequence and amino sequence of PpyHHT gene

2结果与分析

2.1PpyHHT基因克隆与序列分析

用常规PCR技术从‘黄花’和‘绿黄花’梨第8周果实果皮中扩增得到部分基因片段，测序并在NCBI上进行比对分析表明，该片段为PpyHHT基因的部分片段。根据所得序列设计3’端特异引物，进行巢式PCR扩增(第一轮引物为3W和R16326，第二轮引物为3N和R16324)，获得了3’端目的片段。利用DNAMAN6.0软件进行拼接，获得了包含完整开放阅读框的核苷酸序列1 599 bp(图1)，而且‘黄花’和‘绿黄花’cDNA序列完全一致；包括编码444个氨基酸的编码区，264 bp的3’非翻译区(图1)，命名为PpyHHT，提交GenBank，登录号为KX131155。根据DNAMAN6.0软件推测该蛋白分子量是49.91 kD，等电点是4.75。

2.2PpyHHT基因生物信息学分析

图2　PpyHHT基因预测蛋白的结构域分析Fig. 2　Conserved domain analysis of prodicted protein of PpyHHT gene

图3　‘黄花’梨与其他物种 HHT基因氨基酸序列的系统进化树Fig. 3　Phylogenetic tree of the amino acid residues encoded by HHT gene in ‘Huanghua’ pear and other species

利用NCBI蛋白保守结构域数据库(conserved domain database，CDD)对PpyHHT基因编码蛋白的保守区进行预测，结果表明，该蛋白在11～443氨基酸残基之间有一个HHT家族结构域(PLN02481，E值0e+00)(图2)。将PpyHHT基因编码的氨基酸序列进行比对分析，发现PpyHHT与多种植物HHT的相似性在76.6%和98%之间，其中相似性在92%以上的有白梨(Pyrusbretschneideri)、苹果(Malusdomestica)、梅(Prunusmume)、森林草莓(Fragariavesca)等，且白梨最高达98%。分析结果还发现，PpyHHT基因编码的氨基酸序列具有HHT的2个保守结构区域，即HXXXD(第175～179位氨基酸残基)活性位点和D(N)F(V)GWG(第392～396位氨基酸残基)活性位点(图1)，这2个保守区域为酰基转移酶所特有，在植物中高度保守[19-21]。

利用Mega 5软件将这些基因编码的氨基酸序列进行聚类分析，构建系统进化树。从图3可以看出PpyHHT基因编码的氨基酸与其他近源物种在氨基酸水平上高度同源，与白梨亲缘关系最近，这与氨基酸序列比对结果一致，表明PpyHHT基因为HHT的同源基因。

2.3在不同发育时期梨果皮中PpyHHT的表达

图4　不同时期‘黄花’梨和‘绿黄花’梨果皮PpyHHT基因表达量Fig. 4　The relative expression of PpyHHT in the peel of ‘Huanghua’ and‘LÜ huanghua’pear at different stages

在所取样的4个时期，‘黄花’梨PpyHHT基因的表达量均高于‘绿黄花’梨，在第7周表达量差异达到最大，非常有趣的是，此时‘黄花’梨果实褐色开始呈现出来，提示该基因的高表达可能与果皮褐色形成有关。在不同时期‘黄花’梨果皮中，第6周和第7周表达量较高，而第8周和第9周表达量较低，其中第7周的表达量约为第8周的4倍，褐色呈现后的第8周和第9周间表达量相差无几，究其原因可能是PpyHHT需要与相关因子协同作用才能促成褐色前体物质的形成，随着果实色泽的逐渐形成，协同作用减弱，其含量也逐步减少并趋于稳定。PpyHHT基因在‘绿黄花’梨果皮中表达量在第8周最低，为最高表达量的0.25倍，表达量随果实发育呈“先减后增”趋势，这可能是由于在色泽形成关键期相关物质抑制了PpyHHT基因的表达，至第9周‘黄花’梨果实表皮褐色比较明显时，‘绿黄花’梨PpyHHT基因的表达量又增高，这个并没有促进果实形成褐色，最合理的解释可能是除该酶(基因)外，褐色的形成还需要其他因子的参与。

3讨论

本试验成功从‘黄花’梨和‘绿黄花’梨中克隆到一个含有完整阅读框的砂梨PpyHHT基因，生物信息学分析表明，PpyHHT基因编码的氨基酸序列与蔷薇科植物相似性较高(92%以上)，其中白梨最高(98%)，与其他科植物相似度较低(77%左右)。这说明PpyHHT基因属于转移酶类基因家族成员，同时也说明不同物种HHT氨基酸的相似度高低与物种之间的亲缘关系相一致。

Lotfy等[16]研究表明HHT促进马铃薯组织的木栓化，也促进木栓质前体的形成[22]；木栓化组织的酶解及提取物分析表明阿魏酸及阿魏酸酯是木栓质大分子结构的主要成分[6]，因此，HHT可能是通过促进这些主成分的形成而影响木栓质的形成的。本研究显示，‘黄花’梨在果皮色泽形成关键期的HHT表达量明显高于‘绿黄花’梨，这就有可能影响木栓质成分阿魏酸等的形成，进而影响砂梨果皮褐色的形成。

本试验克隆的2个砂梨品种(系)的PpyHHT基因的cDNA序列完全一致，从这个角度上看，‘黄花’梨的绿皮芽变‘绿黄花’梨性状出现差异不是该功能基因发生了突变，但其基因的表达量和表达谱存在明显差异，出现这种情况的原因：一是两个品种(系)间调控该基因表达的调控因子如转录因子基因可能发生了突变。Uauy等[23]研究发现，在栽培小麦品种中转录因子NAM-B1基因由于1个碱基的插入引起移码突变而丧失功能，导致营养成分的降低；二是该基因位点的启动子区域出现了差异。Buzeli等[24]在大豆的研究中发现启动子顺式元件完整与否调控着Bip基因的表达。由此推测，‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨PpyHHT基因在转色关键期的差异表达可能受上述两个因子的影响，究竟是哪个因子在起作用还需要进一步研究。

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(编辑:宋亚珍)

文章编号:1000-4025(2016)06-1105-05

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1105

收稿日期:2016-03-28;修改稿收到日期:2016-05-05

基金项目:国家自然科学基金(31272140)；江苏省农业科技自主创新资金(CX(14)3009)

作者简介:吕照清(1990-)，男，在读硕士研究生，主要从事植物生物技术研究。E-mail:1304971536@qq.com *通信作者:乔玉山，教授，博士生导师，主要从事果树生物技术研究。E-mail:qiaoyushan@njau.edu.cn

中图分类号:Q78

文献标志码:A

Cloning and Expression ofHHTGene in ‘Huanghua’ Pear and Its Bud Mutant ‘Lühuanghua’ Pear (PyruspyrifoliaNakai)

LÜ Zhaoqing,REN Dandan,ZHOU He,QIAO Yushan*

(College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Abstract:The study used fruit peel of sand pear (Pyrus pyrifolia Nakai) cultivars ‘Huanghua’ pear (russet fruit) and its bud mutant ‘Lühuanghua’ pear (green fruit) at 8 weeks after full bloom (WAFB) as experiment materials. the cDNA full-length of HHT gene,which was named PpyHHT (GenBank accession No. KX131155), was cloned by conventional and nest PCR techniques. Sequence analysis showed that the full-length of the PpyHHT ortholog consisted of a 1 335 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide containing 444 amino acid residues. The molecular weight of deduced amino acids was 49.91 kD, with an isoelectric point (pI) of 4.75, which had the highest similarity (98%) and closest relationship with that in Pyrus bretschneideri. Real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) analysis demonstrated that the expression of PpyHHT gene in ‘Huanghua’ and ‘Lühuanghua’ pear peel were changing constantly during the key period (6-9 weeks), and significantly higher in ‘Huanghua’ pear peel than that in ‘Lühuanghua’. PpyHHT gene involved in the formation of sand pear russet/green traits, its expression level differences may play a role in the formation of sand pear skin color.

Key words:Pyrus pyrifolia Nakai; HHT gene; cloning; bioinformatics; gene expression