Piezo2蛋白的生物信息学分析及其在肠道中的表达*

白　涛，钱　伟，汪　欢，张　磊，宋　军，侯晓华

(华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科，武汉 430022)



Piezo2蛋白的生物信息学分析及其在肠道中的表达*

白涛，钱伟，汪欢，张磊，宋军△，侯晓华

(华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科，武汉 430022)

[摘要]目的对Piezo2性质、结构和功能进行预测分析，并检测其在肠道的表达。方法利用Protparam程序预测人Piezo2蛋白基本理化性质；TMHMM Serve 2.0预测跨膜结构域；ProtComp Version 9.0分析亚细胞定位；用SOPMA程序预测其二级结构；SWISS-MODEL服务器生成其三维模型。免疫组织化学染色确定Piezo2在肠道组织的表达位置，以实时定量荧光PCR检测Piezo2在不同肠段的表达量及与Epac1表达的相关性。结果Piezo2蛋白分子式为C14539H22436N3662O4087S130，相对分子质量为318.092×103，等电点pI=5.82。Piezo2蛋白存在35个跨膜结构域，并有多个蛋白修饰位点。免疫组织化学染色发现Piezo2蛋白表达于肠道上皮与神经节，其在结肠表达水平较回肠丰富(P<0.01)，其中结肠Piezo2与Epac1在mRNA水平表达呈正相关(r2=0.65，P<0.01)。结论Piezo2在结肠表达丰富，可能通过Epac1通路参与肠道机械力感知与调控。

[关键词]肠神经系统；肠黏膜；机械门控离子通道；Piezo2

2010年Coste等[1]发现并定义了Piezo2蛋白。通过细胞系中的体外siRNA筛选及电生理实验的方法，证实Piezo2是机械门控离子通道蛋白。Piezo2是非选择性阳离子通道蛋白，受机械信号刺激，通道开放，将机械刺激信号转化为生物电信号。Piezo2表达于传入神经节(如三叉神经节及背根神经节)、梅克尔细胞、肺、膀胱等组织。在生物机体感受机械刺激过程中有重要作用。有关机械刺激的感知的细胞学及分子生物学机制研究尚不清楚，Piezo2蛋白的发现和研究具有重要意义。本文通过生物信息学预测Piezo2蛋白理化性质、蛋白结构、生物学功能，同时检测其在肠道组织中的表达及定位，推测Piezo2蛋白在肠道感知机械刺激信号中可能有重要作用，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料人Piezo2蛋白的基因及其编码蛋白的GenBank登录号依次为JN790819与AFC88283。多克隆抗体Piezo2购自Abcam公司；二抗购自武汉博士德公司；Trizol购自Gibco公司；PCR引物由上海英俊生物有限公司合成；逆转录酶试剂盒购自TAKARA公司；NIH小鼠购自广东省实验动物中心。

1.2方法

1.2.1生物信息学方法利用Protparam在线程序预测人Piezo1蛋白基本理化性质[2]，如相对分子质量、等电点、平均疏水系数等；利用在线系统TMHMM Serve 2.0预测跨膜结构域[3]；利用ProtComp Version 9.0在线工具分析亚细胞定位；利用SOPMA在线程序预测其二级结构[4]；利用SWISS-MODEL服务器生成其三维模型[5]，并在PyMOL Version 1.7.4中编辑。

1.2.2实验室方法4%多聚甲醛固定组织标本24 h后，石蜡包埋。一抗工作浓度为1∶250，4 ℃过夜。二抗为荧光素标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)，中性树胶封片。磷酸缓冲盐溶液(PBS)代替一抗做阴性对照。使用Trizol提取组织RNA(步骤按照产品说明书)，运用逆转录试剂盒使RNA逆转录为cDNA，应用SYBRGreen和实时定量荧光PCR(Real-time PCR)检测仪检测Piezo2的mRNA水平。引物如下，β-actin：上游5′-TGT TAC CAA CTG GGA CGA CA-3′，下游5′-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3′；Piezo2：上游5′-GTG GTA TGC AAC CCA GTA CCC-3′，下游5′-GGC CAT TCT CTA TGG GCA GG-3′；Epac1：上游5′-GTG TTG GTG AAG GTC AAT TCT G-3′，下游5′-CCA CAC CAC GGG CAT C-3′。

1.3统计学处理采用R2.11.1软件，使用t检验和Pearson相关性检验方法进行统计分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1人Piezo2蛋白基本理化性质预测通过Protparam预测Piezo1蛋白基本理化性质，推测蛋白分子式为C14539H22436N3662O4087S130，相对分子质量为318.092×103，等电点pI=5.82，波长280 nm时摩尔消光系数为505 380，半衰期为30 h，平均疏水性系数为-0.086，脂肪系数93.51。不稳定参数为50.26，属不稳定蛋白。Piezo1蛋白所含氨基酸残基数为2 752，其中碱性残基数目为300，酸性残基数为343。所含氨基酸组成为：氨基酸Ala(5.3%)、Arg(4.6%)、Asn(3.3%)、Asp(4.1%)、Cys(1.8%)、Gln(3.6%)、Glu(8.3%)、Gly(4.7%)、His(2.0%)、Ile(7.4%)、Leu(10.7%)、Lys(6.3%)、Met(2.9%)、Phe(6.0%)、Pro(4.0)、Ser(7.7%)、Thr(4.9%)、Trp(2.2%)、Tyr(4.1%)、Val(6.1%)，含Leu和Glu最多，不含Pyl和Sec。

2.2人Piezo2蛋白跨膜结构域、亚细胞定位及翻译后修饰位点分析利用在线系统TMHMM Serve 2.0对Piezo2蛋白进行跨膜结构域预测分析，结果见图1。人Piezo2蛋白存在35个跨膜结构域，编号位置分别为10-41、62-84、122-144、214-236、241-260、267-289、504-526、539-561、581-598、678-700、704-726、733-755、787-809、932-954、959-976、981-1003、1052-1074、1113-1135、1139-1156、1169-1191、1217-1239、1291-1310、1314-1336、1349-1371、1909-1931、1936-1955、1965-1987、2189-2211、2231-2253、2260-2282、2292-2314、2327-2344、2359-2378、2399-2421、2660-2682。使用ProtComp Version 9.0在线工具分析Piezo2蛋白亚细胞定位，结果显示存在于细胞膜、高尔基体、内质网等生物膜结构中。使用MotifyScan进行翻译后修饰位点分析，预测人Piezo2蛋白理论上存在4个酰胺化位点(382-385、1529-1532、2062-2065、2139-2142)，16个N-糖基化位点(95-98、765-768、1009-1012、1013-1016、1020-1023、1030-1033、1085-1088、1713-1716、2114-2117、2125-2128、2525-2528、2539-2542、2559-2562、2572-2575、2622-2625、2634-2637)，8个cAMP-和cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点(384-387、1048-1051、1601-1604、1613-1616、1632-1635、2064-2067、2096-2099、2284-2287)，32个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(97-100、155-158、366-369、405-408、477-480、783-786、823-826、838-841、886-889、896-899、954-957、1203-1206、1284-1287、1515-1518、1556-1559、1604-1607、1718-1721、1722-1725、1767-1770、1782-1785、1795-1798、1810-1813、1819-1822、1844-1847、1857-1860、1861-1864、1879-1882、2054-2057、2086-2089、2101-2104、2223-2226、2495-2498)，19个豆蔻酰化位点(113-118、128-133、216-221、414-419、620-625、761-766、1046-1051、1106-1111、1123-1128、1201-1206、1695-1700、1728-1733、1763-1768、1800-1805、2119-2124、2320-2325、2501-2506、2672-2677、2691-2696)，31个蛋白激酶C磷酸化位点(56-58、102-104、110-112、195-197、321-323、459-461、483-485、871-873、954-956、1004-1006、1310-1312、1358-1360、1390-1392、1604-1606、1863-1865、1897-1899、1961-1963、2070-2072、2106-2108、2113-2115、2116-2118、2122-2124、2127-2129、2135-2137、2160-2162、2282-2284、2384-2386、2550-2552、2561-2563、2576-2578、2623-2625)，2个酪氨酸激酶磷酸化位点(1790-1797、2382-2388)。

图1　Piezo2蛋白进行跨膜结构域预测分析

A：预测模型1；B：预测模型2；C：预测模型3。

图2人Piezo2蛋白三级结构

2.3人Piezo2蛋白二级、三级结构及功能预测SOPMA在线程序分析结果显示，人Piezo2蛋白含2 752个氨基酸，其中1 301个(47.27%)氨基酸可能形成α螺旋，537个(19.51%)氨基酸形成延伸链，204个(7.41%)氨基酸形成β转角，710个(25.80%)氨基酸形成无规则卷曲。通过SWISS-MODEL服务器生成三维模型，在PyMOL Version 1.7.4中进行结构编辑，生成人Piezo2蛋白三维模型如图2。

2.4Piezo2蛋白在肠道中的表达Piezo2表达于上皮与肠神经系统，Piezo2蛋白在小鼠结肠组织中表达见图3。

2.5Piezo2蛋白在小鼠肠道表达差异Real-time PCR检测小鼠不同肠段Piezo2与Epac1 mRNA表达情况，结肠Piezo2及Epac1表达较小肠丰富(P<0.01)，见图4A、B；结肠Piezo2与Epac1在mRNA水平表达呈正相关(r2=0.65，P<0.01)，而在小肠未检测出相关性，见图4C、D。

图3　Piezo2蛋白在结肠中的表达(SABC，×400)

A：不同肠段Piezo2表达；B：不同肠段Epac1表达；C：小肠Piezo2与Epac1表达；D：结肠Piezo2与Epac1表达。

图4不同肠段Piezo2与Epac1 mRNA表达情况

3讨论

Piezo2是重要的机械敏感离子通道蛋白，在机械刺激感知中有重要作用。已有研究发现，Piezo2表达于初级传入神经(三叉神经节、背根神经节)，参与其机械信号感知，在背根神经节中干扰Piezo2表达可以调节细胞的感觉阈值[6-9]。Piezo2在梅克尔细胞中表达，在皮肤感受触觉中有重要作用[10-12]。此外，Piezo2在DRG中与伤害感受器共表达，提示了感受机械伤害性刺激的重要分子机制[13]。Piezo2的突变与神经肌肉功能异常的疾病相关，在远端关节挛缩、戈登综合征及马丹沃克综合征中发现了Piezo2的突变，提示Piezo2在调节神经及运动功能中有重要作用[14-15]。

本文运用生物信息学工具预测Piezo2蛋白理化性质、结构及相关功能。Piezo2具有超过2 500氨基酸残基，是多次穿膜的大分子蛋白。其中α螺旋(47.27%)比例较大，有利于穿膜结构的稳定，无规则卷曲(25.80%)存在一定比例，并可能成为蛋白质功能调节和修饰位点的存在位置。翻译后修饰位点预测发现，在Piezo2蛋白中，具备多个重要修饰位点，其修饰位点功能的研究有待于进一步研究。本研究通过实验室方法证实，Piezo2在肠神经系统中表达，结肠水平表达较回肠丰富，且表达在结肠与Epac1相关。肠神经系统有“肠脑”之称，在肠道感知肠腔刺激、调节肠道内环境稳态、调节肠道动力等过程中有重要作用。Piezo2可能在肠道感知机械刺激中有重要功能，Epac1通路同样可能参与Piezo2功能调控[8,16]。

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doi:·论著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.004

*基金项目：国家自然科学基金资助项目(81200271)。

作者简介：白涛(1989-)，在读博士，主要从事胃肠功能性疾病研究。△通讯作者，E-mail：song111jun@126.com。

[中图分类号]R574.6

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)15-2040-03

(收稿日期：2015-11-14修回日期：2016-01-08)

Bioinformatics analysis of Piezo2 and its expression detection in the gut*

Bai Tao，Qian Wei，Wang Huan，Zhang Lei，Song Jun△，Hou Xiaohua

(DepartmentofGastroenterology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430022,China)

[Abstract]ObjectiveTo predict and analysis the physical and chemical properties as well as the structure and function of Piezo2,and to detect the expression of Piezo2 in gut.MethodsPhysical and chemical properties of Piezo2 were predicted with Protparam.Transmembrane domain was predicted with TMHMM Serve 2.0.Subcellular location was analyzed with ProtComp Version 9.0.Protein secondary structure was predicted with SOPMA program.Three-dimensional model was created with SWISS-MODEL.Location of Piezo2 in intestine was analyzed with immunohistochemical staining and RT-PCR was performed to compare the expression in different segment of intestine and correlation to Epac1.ResultsMolecular formula of Piezo2 was C14539H22436N3662O4087S130with molecular weight of 318.092×103 and isoelectric point of 5.82.Piezo2 had 35 transmembrane domains and many post-translational modification sites.Piezo2 existed in intestinal epithilial tissue and ganglion cells.Expression of Piezo2 in colon was much more abundant than that in small intestine(P<0.01) and positive correlated to Epac1 (r2=0.65，P<0.01).ConclusionColon is rich in Piezo2.Piezo2 might play a key role in function regulation of intestinal epithelium and enteric nervous system by Epac1 pathway.

[Key words]enteric nervous system；intestinal mucosa；mechanically gated ion channels;Piezo2