异荭草素对老年耐药性前列腺癌的逆转作用

李亚芹　臧学丽　冯贺达　杨　婷　章春宇

(长春医学高等专科学校，吉林　长春　130031)



异荭草素对老年耐药性前列腺癌的逆转作用

李亚芹臧学丽冯贺达杨婷章春宇1

(长春医学高等专科学校，吉林长春130031)

〔摘要〕目的探讨异荭草素对耐药性前列腺癌的逆转作用机制。方法利用细胞增殖检验试剂盒(MTS)检测细胞活性，用流式细胞仪及Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡，Western印迹检测间质样改变及相关蛋白。结果MTS检测细胞活性发现单独使用异荭草素、紫杉醇时细胞抑制率增加并不明显，而两者联合可明显增加抑制率。流式细胞仪检测细胞凋亡显示，当异荭草素联合紫杉醇作用于耐药细胞时，细胞出现明显凋亡可达57.26%。Hoechst33342荧光染色也发现二者共同作用时细胞呈现蓝色，出现细胞核固缩、致密浓染、颜色发白等凋亡特征。Western 印迹检测E-cadherin、Notch-1表达情况，发现异荭草素能增加E-cadherin的表达，同时抑制Notch-1表达。结论异荭草素能够逆转前列腺癌细胞PC3-TxR的耐药情况，其作用机制可能是通过增加E-cadherin、抑制Notch-1的表达而实现的。

〔关键词〕耐药；前列腺癌；异荭草素

前列腺癌是一种激素依赖肿瘤，为老年男性常见疾病〔1〕。异荭草素是一种黄酮类物质，在西番莲、荭草及竹叶等植物中有丰富的含量〔2,3〕。已有研究证实异荭草素具有抗肿瘤、抗感染、抗氧化等作用〔4,5〕，但其对逆转耐药肿瘤的作用目前尚无报道。本研究旨在探讨异荭草素对老年前列腺癌患者耐药的逆转作用。

1材料和方法

1.1实验材料和仪器前列腺癌耐药细胞株PC3-TxR由吉林大学转化医学院惠赠。异荭草素，上海永恒生物科技；细胞增殖检验试剂盒(MTS)，美国Sigma；二甲基亚硫(DMSO)，美国MP Biomedicals；RPML-1640培养基，吉诺生物医药技术有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，BIOBOX；胎牛血清、胎牛血清白蛋白(BCA)定量，美国Thermo Scientific；脱脂奶粉的Tris盐酸缓冲液(TBST)、四甲基乙二胺(TEMED)、琼脂糖，国药集团化学试剂有限公司；Hoechst33342，美国Sigma；兔抗人E-cadherin、兔抗人Notch-1、β-actin，美国Cell Signaling Technology；二抗，上海生工生物工程有限公司；PVDF膜，美国Millipore。

超净工作台，德国Heraeus；培养瓶，美国BD Falcon；离心机，美国Sigma；96孔板，美国Coring；酶标仪Gen5 1.10，美国BioTek；流式细胞仪，美国BD FACS Calibur；Ckx41倒置荧光显微镜，日本Olympus；220 V电泳供电装置PowerPac、165-8001型伯乐小型垂直电泳、221BR Trans-Bolt SD半干转印槽、ChemiDox XRS 凝胶成像系统，美国Bio-Rad。

1.2方法

1.2.1MTS检测细胞活性将处于对数生长期的1×104/L PC3-TxR接种到96孔板上，每孔200 μl。置于37℃，5%CO2培养箱中24 h。弃去上清，磷酸缓冲液(PBS)洗涤1次。异荭草素组加入400 μl 40 μmol/L异荭草素；紫杉醇组加入4 mg/ml紫杉醇400 μl；混合组加入40 μmol/L异荭草素200 μl，4 mg/ml紫杉醇200 μl；空白对照组加入等量的细胞培养液。每组设5组复孔。继续培养24、48、72 h，在结束培养前4 h向各孔中加入10 μl MTS，混匀后待实验结束后弃去上清液，在酶标仪上检测490 nm处的吸光值。抑制率=(1-实验组OD值/细胞组OD值)×100%。

1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡情况将对数生长期的肿瘤细胞接种于培养瓶中，之后按1.2.1中分组加入药物，作用48 h后收集细胞，常温1 000 r/min离心5 min，弃去培养液，使用预冷PBS重悬细胞后再次按上述条件离心，重复2次。将收集的细胞用预冷75%乙醇固定。再次离心后弃去固定液，PBS洗涤2次。加入200 μl碘化丙啶(PI)，置于4℃环境25 min。400目筛网过滤1次后使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.3Hoechst33342荧光染色将处于对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，待细胞贴壁生长24 h后，按上述分组情况加入相应药物。置于37℃，5%CO2培养箱中24 h。之后弃去上清液，PBS洗涤2次，以醋酸∶甲醇1∶3(V/V)室温固定10 min。弃去固定液，加入10 μg/ml Hoechst33342染液覆盖细胞，37℃恒温箱中染色10 min，弃去上清液后PBS洗涤，洗掉残留染料，避光放置，340 nm激发荧光显微镜下观察。

1.2.4Western 印迹将上述分组后处理的细胞进行蛋白提取，并将蛋白溶液的浓度配置为相同。配制15%分离胶，4%浓缩胶，30 g蛋白样品上样，调整电压100 V电泳2 h，之后90 V电压聚偏氟乙烯(PVDF)膜转膜90 min，室温下牛奶封闭1 h，1∶1 000的E-cadherin、Notch-1，4℃过夜，TBST洗涤3次，5 min/次。加入1∶5 000二抗室温下反应1 h，再次使用TBST洗涤。化学法发光反应、曝光、拍照并进行灰度值分析。

1.3统计学方法应用SPSS19.0软件进行t检验。

2结果

2.1MTS检测细胞活性除异荭草素作用24 h后细胞抑制率与对照组无明显差异外，其余各组与对照组相比对耐药细胞的抑制率有统计学差异(P<0.05)。单纯使用异荭草素或紫杉醇作用于耐药细胞抑制率均未达到50%，但二者共同作用后抑制率明显增加。考虑异荭草素能够逆转耐药。见图1。

图1　MTS检测细胞活性

2.2流式细胞仪检测细胞凋亡单独使用异荭草素及紫杉醇作用细胞48 h后细胞凋亡率为23.54%、37.23%，均未达到50%，可见促进细胞凋亡的情况并不理想，二者共同作用后凋亡率为57.26%。可见异荭草素联合紫杉醇后细胞的耐药情况得到改善。

2.3Hoechst33342荧光染色当细胞发生凋亡时Hoechst33342进入细胞，细胞呈现蓝色，细胞核固缩、致密浓染，颜色发白。对照组及异荭草素组的细胞蓝染，但细胞核固缩及致密不明显，此时细胞凋亡的量少。紫杉醇作用细胞后出现明显核固缩、致密、颜色发白。当异荭草素联合紫杉醇时上述现象更加明显。见图2。

2.4Western 印迹检测对照组与紫杉醇组的E-cadherin、Notch-1表达情况一致，无统计学差异。而异荭草素组及混合组E-cadherin明显增多，Notch-1明显减少，与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。见图3。

与对照组相比：1)P<0.05图3　Western 印迹对耐药蛋白的检测

3讨论

由于前列腺癌起病隐匿，故患者发现时大多已进入疾病的晚期阶段。目前治疗前列腺癌的主要手段有雄激素阻断、外科手术等，但治疗效果平平；并且耐药前列腺癌让临床治疗更加困难〔6〕。

有文献报道耐药细胞的形态呈梭形，细胞间疏散，呈间质样形态改变，例如肺癌、乳腺癌等〔7〕。本研究通过Western 印迹实验证实了耐药的前列腺癌细胞发生了间质样形态改变，同时异荭草素可以增加E-cadherin改变这一过程。本实验中异荭草素能够明显减少Notch-1的表达，从而使耐药前列腺癌细胞对紫杉醇的敏感性增加。

4参考文献

1 唐志柳，白洁，顾丽娜，等.2000～2010 年我国前列腺癌和乳腺癌流行状况的系统性综述〔J〕.中国肿瘤，2013；22(4):260-5.

2窦妍，翟延君，佟苗苗，等.HPLC 测定不同采收期荭草中荭草素、异荭草素的含量〔J〕.中国实验方剂学杂志,2012；18(2):62-4.

3Lim JH，Park HS，Choi JK，etal.Isoorientin induces Nrf2 pathway-driven antioxidant response through phosphatidylinositol 3-kinase signaling〔J〕.Arch Pharmacal Res, 2007;30(12):1590-8.

4Park HS，Lim JH，Kim HJ，etal.Antioxidant flavone glycosides from the leaves of sasa borealis〔J〕.Arch Pharm Res,2007；30(2):161-6.

5Conforti F，Rigano D，Menichini F，etal.Protection against neurodegenerative diseases of Iris pseudopumila extracts and their constituents〔J〕.Fitoterapia,2009；80(1):62-7.

6韩苏军,张思维,陈万青，等.中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析〔J〕.临床肿瘤学杂志，2013；18(4):330-4.

7Chen D,Huang J,Zhang K,etal.MicroRNA-451 induces epithelial-mesenchymal transition in docetaxel-resistant lung adenocarcinoma cells by targeting proto-oncogene c-Myc〔J〕.Eur J Cancer，2014；50(17):3050-67.

〔2015-12-20修回〕

(编辑袁左鸣/腾欣航)

通讯作者：章春宇(1970-)，女，主任药师，主要从事药品质量控制研究。

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)13-3142-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.021

1长春健康教育中心

第一作者：李亚芹(1964-)，女，副教授，主要从事生物药物研发研究。