装载方式对实验室高温湿热灭菌效果的影响研究

戴虹梅　邹　坤　贺海波　尉小琴　颜为红　汪鋆植

(1. 三峡大学 生物与制药学院， 湖北 宜昌　443002; 2. 奥美医疗用品有限公司, 湖北 宜昌　443000)



装载方式对实验室高温湿热灭菌效果的影响研究

戴虹梅1，2邹坤1贺海波1尉小琴1颜为红1汪鋆植1

(1. 三峡大学 生物与制药学院， 湖北 宜昌443002; 2. 奥美医疗用品有限公司, 湖北 宜昌443000)

摘要：微生物实验室高温湿热灭菌装载对灭菌效果有重要影响，由于灭菌物品的多样性，没有固定的执行方案，而使用者通常依赖于厂商的设备说明，应用时也容易忽略装载方式对灭菌效果的影响．本研究以不同的灭菌器载物篮和器皿摆放方向进行灭菌，对比观察灭菌效果．通过采用Ellab温度、压力传感器，MESA生物指示剂，采集灭菌过程的温度、压力，确认是否达到灭菌保证水平，并比较各种装载方式下的数据差异；分析灭菌阶段相同时间不同布点位置的温度，灭菌阶段相同布点、不同时间的温度，其波动、极差、F0值在可接受范围内进行比较；将相同时间采集的压力值对应理论饱和蒸汽温度与各点的实测温度进行比较；同时，检查生物指示剂是否成功灭活．结果表明：①空载时，底部无孔网篮与全网篮两种方式没有明显差异，均符合执行标准．②器械灭菌程序，量筒口朝上时，量筒内升温慢，F0值达不到执行标准；量筒口朝下时符合执行标准．③在培养基灭菌程序下对比底部无孔网篮和全网装载篮模式，无孔网篮置于上层或下层，置于中间的培养基升温慢且F0值达不到执行标准，相应的生物指示剂培养结果为阳性；上下层都采用有孔网篮时，符合执行标准，且相应的生物指示剂培养结果为阴性．无论装载篮还是待灭菌物品，其装载方式对冷空气的排空和蒸汽的穿透有重要影响．应本着利于空气流通等原则，基于装载方式的考虑实施验证，从而避免装载不当导致失败，保证高温湿热灭菌效果．

关键词：装载方式；高温湿热灭菌；效果

蒸汽是一种无色、无味、无毒无害的气体，生产成本低，获取方法简单，温度高、穿透力强，是一种灭菌效果好、无污染的灭菌方法[1]．压力蒸汽灭菌器以蒸汽作为灭菌因子，在灭菌器内不存在冷空气的条件下，充入纯蒸汽并施加压力可提高蒸汽的温度，当蒸汽与物品充分接触时放出潜热加热物品达到杀灭微生物的目的[2]．

实验室常用灭菌器主要有下排式和预真空两种．下排式压力蒸汽灭菌方法延袭使用了100多年，其在蒸汽置换冷空气时具有不彻底性和灭菌内室的上下层温差过大等缺点[3]．灭菌效果比下排式灭菌稳定可靠、工作效率更高的预真空灭菌器，自20世纪50年代被英国率先研究出来，越来越被广泛使用，但预真空灭菌器也有不足之处，比如：设备费用高、柜体密封性要求高、小装量灭菌效果差及不适用于瓶装液体灭菌等．而这些不足，恰是下排式压力蒸汽灭菌器的长处．同时由于控制方便、费用经济，各实验室、医院及卫生单位仍普遍采用下排式高压蒸汽灭菌器．高压蒸汽灭菌器种类繁多，实验室购置的灭菌器究竟能否满足灭菌的实际需求以及如何正确使用，在灭菌器正式投入使用前须对设备运行状态、运行最佳参数等进行确认，从而确保实验室灭菌可靠性．实验室灭菌物品多种多样，验证前需要加以区分，不同种类的物品应采用不同的灭菌方式乃至设计合适的装载方式．但实际工作中，许多使用单位主要依赖设备说明书和灭菌设备厂商的指导，比较常见的是忽略了装载方式的影响．在实验室灭菌验证时发现，装载方式对灭菌效果是一重要影响因素．本次以某知名国产下排式80L立式高压蒸汽灭菌器为例，根据验证实施空载温度分布测试、实验室器具灭菌的装载温度分布测试、装载热穿透测试和微生物挑战测试，观察、比较装载方式的影响．按121℃ 30 min空载、器皿灭菌和121℃ 15 min培养基灭菌，验证温度分布、装载热穿透和微生物挑战，评估不同装载方式对灭菌效果的影响．

1材料

1.1试验器具

灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司；无线温度传感器，丹麦ELLAB股份有限公司；无线压力传感器，丹麦ELLAB股份有限公司；不锈钢过滤支架，蒸汽医用纸包裹支架漏斗接口；不锈钢滤杯；血清瓶；空量筒；移液器枪头；吸管．

1.2试验试剂

TSB培养基，美国BD公司；EZS/6自含式生物指示剂(含菌量达106)，美国MESA公司；PS-6-50自含式生物指示剂(含菌量达106)，美国MESA公司．

2方法[4]

2.1空载程序

出厂标配网篮为一个底部有孔网篮和一个底部无孔网篮(如图1所示)，设计初衷是避免灭菌时腔体内沸腾的水溅湿物品，但在预验证试验时发现底部无孔网篮无论置于上层还是下层，其底部中心为整个腔室内的冷点，存在灭菌失败的风险．此次试验方案中将设计两种空装载，用以评估可接受的装载方式：空载1：为上层全网篮+下层底部无孔网篮，空载2：为上下层全网篮．

A.底部有孔全网篮；B.底部无孔网篮；C.网篮示意图图1　灭菌器网篮

121℃×30 min空载温度分布测试，确定灭菌循环的热力学特性，以及灭菌器腔体的“冷点”和“热点”．(“冷点”和“热点”的判定依据为各个温度传感器在灭菌循环结束后的总计F0值)．无线温度传感器设置为每隔30 s记录一次数据；将灭菌网篮分为上层顶部、上层底部、下层底部3个布点层，分别设置温度测量点，覆盖到冷点、热点及降温最慢的点；其中一个温度测量点设置在灭菌器排水口，同时近温控器(如图2所示)．每柜放置一枚压力传感器，其换算饱和蒸汽温度与各温度传感器进行比较．

A.上层上部；B.上层底部；C.下层底部；T.温度传感器；P.压力传感器图2　空载测试装载示意图

2.2温度分布、热穿透和微生物挑战测试

2.2.1器械灭菌程序

具体操作过程如下：①采用全网篮，按“2.方法”放置一层器具(不锈钢过滤支架较长，无法放置二层网篮)，通过预实验找到各器具的最佳放置方法(器具的中空管路纵向放置，容器的开口方向朝下为最佳)及每种器械中温度最难穿透部位，无线温度传感器设置为每隔30 s记录一次数据；每包器具放置二枚传感器，分布于器具包中部及下1/3处；其中一个器具包靠近排水口，同时近温控器．②放置一枚压力传感器，其换算饱和蒸汽温度与各温度传感器进行比较．③每个测温点放置自含式生物指示剂，培养基灭菌时需置于液体中．灭菌程序结束后，与对照品同时培养，应无菌生长．④记录两种装载方式，即器械1为量筒口朝上，器械2为量筒口朝下(如图3所示)．

T：温度传感器；P：压力传感器图3　器械最大装载示意图

2.2.2培养基灭菌程序

具体操作过程如下：①试验三种装载方式：培养基1为上层全网篮，下层底部无孔网篮；培养基2为上层底部无孔网篮，下层全网篮；培养基3为上下层全网篮．无线温度传感器设置为每隔30 s记录一次数据，放置于每层中心及四周的血清瓶内，传感器探头浸入培养基；另有2枚温度传感器分别置于上、下层网篮中央．②放置一枚压力传感器，其换算饱和蒸汽温度与各温度传感器进行比较．③每个测温点放置自含式生物指示剂，培养基灭菌时需置于液体中．灭菌程序结束后，与对照品同时培养，应无菌生长(如图4所示)．

A：上层底部；B：下层底部；T：温度传感器；P：压力传感器图4　培养基最大装载示意图

2.2.3执行标准

在灭菌过程中具体按照下列标准进行：①在灭菌阶段，除浸入培养基的温度传感器外，每一个温度传感器的温度保持在121～124℃范围；②在灭菌阶段，除浸入培养基的温度传感器外，同一时刻不同温度传感器的温度极差≤2℃；③在灭菌阶段，除浸入培养基的温度传感器外，每一个温度传感器的温度变化范围≤2℃；④空载及器皿灭菌程序，每一个温度传感器F0≥30 min；⑤培养基灭菌程序，每一个探头浸入液体内部的温度传感器F0≥12 min；⑥在灭菌阶段，压力传感器均值查对应的饱和蒸汽温度与每一个温度传感器的温度极差≤2℃，其中培养基灭菌的压力传感器与探头不浸入培养基的两个传感器作比较．

3结果

3.1空载验证结果分析

空载1：使用原厂设计的上层网篮+下层底部无孔网篮时，灭菌器内温度分布符合要求．在灭菌阶段，每一个温度传感器的温度保持在121～124℃范围(最高温度为123.02℃，最低温度为121.25℃)；同一时刻，各监测点温度相差在0.29℃内，单点温度波动在1.77℃；F0值46.23 min；同时刻压力传感器换算饱和蒸汽温度与各测点温度值差值最大为0.72℃，在误差范围内，表明各测点蒸汽为饱和蒸汽．

空载2：上下层都改为采用全网篮后，灭菌器内温度分布符合要求，与前一种装载没有明显差异；在灭菌阶段，每一个温度传感器的温度保持在121～124℃范围(最高温度为123.17℃，最低温度为121.54℃)；同一时刻，各监测点温度相差在0.34℃内，单点温度波动在1.63℃；F0值47.28 min；同时刻压力传感器换算饱和蒸汽温度与各测点温度值差值最大为0.70℃，在误差范围内，表明各测点蒸汽为饱和蒸汽．

3.2温度分布、热穿透和微生物挑战测试结果分析

3.2.1器械灭菌

器械1：量筒口朝上时，灭菌阶段量筒内多个时间温度未达到121℃，最高温度121.81℃，F0值28.14 min未达到验证标准；灭菌开始时，该点测温度数据与压力传感器换算饱和蒸汽温度差值达5.26℃，11 min后两者差值在2℃的误差范围，说明量筒口朝上不利于冷空气排出和热穿透；虽然生物指示剂培养结果为阴性，但仍认为此种装载不能保障灭菌效果．

器械2：量筒朝下时，灭菌阶段量筒内温度在标准121～124℃内(最大值122.95℃，最小值121.28℃)，F0值45.57 min，且各测温点数据与压力传感器换算饱和蒸汽温度差值在2℃误差范围内(最高1.65℃)，生物指示剂培养结果为阴性，符合标准．

3.2.2培养基灭菌

培养基1：上层网篮，下层底部无孔网篮：灭菌阶段，压力传感器换算饱和蒸汽温度为理论值，位于上层网篮中间未浸入培养基的测温点温度与理论值最大相差0.88℃，说明灭菌阶段为饱和蒸汽；下层底部无孔网篮中间未浸入培养基的测温点温度与理论值之差4.60～13.38℃，说明此区域灭菌阶段为不饱和蒸汽；下层中间的培养基液体F0值6.56 min，不符合标准要求，且该层生物指示剂培养结果均为阳性．灭菌失败．

培养基2：下层网篮，上层底部无孔网篮：灭菌阶段，压力传感器换算饱和蒸汽温度为理论值，位于上层底部无孔网篮中间未浸入培养基的测温点温度与理论值之差5.14～15.53℃，说明灭菌阶段为不饱和蒸汽；下层底部无孔网篮中间未浸入培养基的测温点温度与理论值最大相差1.42℃，说明灭菌阶段为饱和蒸汽；上层中间的培养基液体F0值7.87 min，不符合标准要求，该层生物指示剂培养结果为阳性．灭菌失败．

培养基3：上下层都改为采用全网篮后，冷点F0值已达12.61 min，灭菌阶段，压力传感器换算饱和蒸汽温度理论值与对应时间点未浸入培养基传感器测温之差最大为1.45℃，说明为饱和蒸汽，所有生物指示剂培养结果阴性，符合灭菌要求．

表1　不同装载方式下温度分布、温度波动、F0值及与理论饱和蒸汽温度差值的对比分析

注：灭菌阶段各时间点压力对应理论饱和蒸汽温度与实际温度最大偏差，其中培养基灭菌时实际温度指与不浸入培养基的传感器对比．空载1：上层网篮+下层底部无孔网篮；空载2：上、下层网篮；器械1：网篮，量筒口朝上；器械2：网篮，量筒口朝下；培养基1：上层网篮+下层底部无孔网篮；培养基2：上层底部无孔网篮+下层网篮；培养基3：上、下层网篮．

4讨论

本研究以空载、器械灭菌和培养基灭菌的几种常用装载和易出现的偏差为例，表明装载方式对实验室高温湿热小型灭菌器的灭菌效果有显著影响．实际工作中，设定灭菌装载前，应针对具体设备和参数进行试验，获取充分的数据，以规范实验室灭菌．应考虑装载物品不可触及腔壁，尽可能采用网篮架子并使物品间留出足够的空间(以插入伸直的手为标准)以供排空和蒸汽循环，不应叠放物品包，避免混装，混装时将金属类物品置于下层从而避免金属上的冷凝水打湿其他物品，容器口朝下或略侧倾向下，装载量一般不超过灭菌器容量的80%，大包物品在上，小包物品在下等等，总之灭菌器不可超载，必须有足够空间使蒸汽能在物品间形成内循环，利于热穿透[5]．基于装载方式的考虑实施验证，从而避免装载不当导致验证沦为无效率的试验，使以证明灭菌效果稳定为目的的验证，直达目标，更为有效．

在实验中，我们结合灭菌器工作原理和数据，表明装载方式对冷空气的排空和蒸汽的穿透有重要影响，其中包括承装物品的网篮．空载试验时，没有物品阻挡，冷空气较容易扩散并排出；盛放物品后，网篮密封的弊端即体现出来．盛放待灭物品的网篮底部密封时，严重阻碍了冷空气下排和蒸汽的穿透，影响灭菌质量；更换网篮后，冷空气下排畅通，并利于蒸汽穿透，从而保障灭菌质量；在液体灭菌时，热穿透的影响表现尤为突出，装载篮阻碍排冷空气及蒸汽穿透，直接导致灭菌失败，更换为网篮时即满足灭菌要求．器皿口朝上时，同样存在排冷空气受阻问题，同一批灭菌锅内，口朝上的器皿采集温度明显偏低，而从其他器皿采集到的温度比较均匀，满足灭菌要求；器皿口朝下时，冷空气得以排出，温度分布均匀，符合要求，保证了灭菌质量．

参考文献：

[1]陈岚.蒸汽灭菌及微生物验证[J]．海南医学,2000,11(4)：56-57．

[2]从莉.预真空压力蒸气灭菌器使用与监测的研究进展[J]．医疗装备,2004(1)：16-17．

[3]任南.压力蒸汽灭菌的若干问题[J]．中国感染控制杂志,2004,3(4)：383-384．

[4]NHS estates an executive agency of the department of health, HTM2010 sterilization-Part 3 validation and verification (SHTM)[OL/EB]． NHS Scotland, P&EFEx： http：//www.ournhsscot- land.com/．

[5]ANSI/AAMI ST79：2010/A2： 2011 Comprehensive guide to steam sterilization and sterility assurance in health care facilities, Amendment 2[S]． The Association for the Advancement of Medical Instrumentation．

[责任编辑周文凯]

收稿日期：2015-09-05

基金项目：湖北省自然科学基金项目(2013CFB224)

通信作者：贺海波(1972-)，男，副教授，博士，主要从事天然药物的活性评价研究．E-mail：hjy219@126.com

DOI：10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.01.023

中图分类号：R-33

文献标识码：A

文章编号：1672-948X(2016)01-0108-05

Effect of Loading Method on Sterilization of High Temperature and Humidity in Laboratory

Dai Hongmei1，2Zou Kun1He Haibo1Yu Xiaoqin1Yan Weihong1Wang Junzhi1

(1. College of Biological & Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China; 2. Allmed Medical Products Co., Ltd., Yichang, 443000, China)

AbstractThe sterilization effect of the high temperature and humidity in the microbiological laboratory is important. Due to the diversity of sterilization items, no fixed execution plan, the user usually depend on the manufacturer's device, which often appears that the effect of loading method on sterilization effect may also be neglected. In this study, different loading baskets and containers placed in the sterilizer direction were sterilized, observed sterilization effect. By Ellab temperature, pressure sensor, MESA biological indicator, the temperature and pressure during the process of sterilization were collected, and confirm whether to reach the level of sterilization, and compared the data of different loading modes, analyzed the same time in different stages of location temperature sterilization, the same time, the different temperature distributions during the process of sterilization. The fluctuation, range, and F0 values were compared in the acceptable range. The pressure value of the same time was compared with the theoretical saturated steam temperature and the measured temperature of the points. At the same time, we check whether the biological indicator was successful. In the study, we found that ① When no-loading, the two ways of bottom hole and the basket have no obvious difference, which are in line with the implementation of standards. ② Instrument sterilization procedures, the cylinder mouth upward, the cylinder is slowly warming up to the standard. The cylinder mouth down was also in line with the implementation of standards. ③ In contrast under the bottom of the culture medium sterilization procedures without holes and the whole network loading basket mode, no hole is arranged on the upper basket, the temperature of the nutrient medium placed in the middle rise slowly; and the F0 value is not up to the standard; and the corresponding biological indicator culture results were positive under the culture medium sterilization program. The use of a hole basket was in line with the implementation of standards, and the result of the corresponding biological indicator is negative. Whether the loading basket or the goods to be sterilized, the loading way of cold air and steam penetration has an important effect. Based on the consideration of the loading method to implement the verification, we should be in favor of air circulation and other principles, avoid the failure caused by improper loading to guarantee the effect of high temperature and humidity sterilization in the microbial laboratory.

Keywordsloading mode;high temperature and humidity sterilization;effect