紫花苜蓿病毒病症状类型及病原检测

周其宇，梁巧兰，韩 亮

(甘肃农业大学植物保护学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)



紫花苜蓿病毒病症状类型及病原检测

周其宇，梁巧兰，韩 亮

(甘肃农业大学植物保护学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

摘要：本研究为了探明甘肃省兰州市紫花苜蓿(Medicago sativa)侵染病毒病的症状类型、病原种类以及寄主范围，进行了田间调查和室内酶联免疫检测。田间调查确定了苜蓿病毒病在兰州市安宁区和皋兰县以及白银市景泰县均有发生，其中景泰县的发病率和病情指数均最高，分别为43.33%和26.08；共采样90份，检查30份，检查比例为30%。检测到的病原有苜蓿花叶病毒(AMV)、白三叶草花叶病毒(WCMV)、菜豆黄花叶病毒(BYMV)和豇豆花叶病毒(CPMV)4种，检出率分别为100.00%、50.00%、75.00%和75.00%，且存在复合侵染现象，复合侵染率达50.00%；寄主范围测定供试植物共6科17属18种，经测定，AMV可以侵染6科15种植物，WCMV可以侵染4科8种植物，BYMV和CPMV可以侵染3科7种植物，4种病毒可复合侵染6科14种植物。

关键词：紫花苜蓿；病毒病；症状类型；寄主范围

苜蓿(Medicagosativa)是全世界最重要的豆科牧草，被誉为“牧草之王”[1]，不仅产草量高、草质优良，而且具有营养丰富、栽培规模大等优势，是苜蓿产业化和发展节粮畜牧业的重要选择之一[2-4]，在退耕还林还草、农业生产结构调整中是首选牧草。目前，我国苜蓿种植面积居各种牧草之首，达2 000万hm2，居世界第2位，甘肃省紫花苜蓿种植面积居全国第1，草产品不仅远销上海、广东等省(市)，还出口日本、韩国等地[5]，特别是近几年随着我国草地畜牧业的发展、退耕还林还草政策实施、农业产业结构调整以及一些国营、私营企业以独立经营或公司加农户等不同形式的参与，大力发展苜蓿产业是一项符合我国农业发展战略、获取生态效益和社会效益的“朝阳产业”；在改善生态环境、优化农牧结构、提高土地资源及提高农业经济效益中发挥着重要的作用；2012年1月中央1号文件“实施振兴奶业苜蓿发展行动”颁布，使我国草畜产业结构趋于合理化、高效化、规模化[6-7]。

随着苜蓿种植面积的扩大，苜蓿病毒病发生越来越严重，已限制了苜蓿的生产及其产业的发展。田间发病率超过了80%，感病植株严重矮化、叶片皱缩变黄、逐渐脱落，牧草蛋白质含量下降、牧草干重降低37%～66%(田间)、根瘤数降低31%～67%(温室)、花粉萌发率降低21.5%(盆栽)[8]，植物雌激素积累，严重影响了牧草的产量、品质，还可对动物采食牧草的用量及频率产生重大影响，甚至会对人或者动物产生或多或少的损害。

研究发现，已经有十多种病毒可以侵染苜蓿，即苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus，AMV)、三叶草黄叶脉病毒(clover yellow vein virus，CYVV)、白三叶花叶病毒(white clover mosaic virus，WCMV)、菜豆黄花叶病毒(bean yellow mosaic virus，BYMV)、豇豆花叶病毒(cowpea mosaic virus，CPMV)、花生矮化病毒(peanut stunt virus，PSV)、红三叶草明脉花叶病毒(red clover vein mosaic virus，RCVMV)等[9-13]；目前对于苜蓿病毒病病原仅限于侵染苜蓿的豇豆花叶病毒、苜蓿花叶病毒生物学特性等研究[14-22]。为此，对甘肃省苜蓿病毒病发生情况、病原种类及寄主范围等问题进行研究，以期为有效防治苜蓿病毒病，提高苜蓿产量和品质，抗病毒品种选育，发展畜牧业和牧草种植业提供基础。

1材料与方法

1.1苜蓿病毒病田间发生情况调查

在2015年6月10日-15日，采用五点取样法，按以下分级标准分别对甘肃农业大学苜蓿试验田、皋兰县及景泰县苜蓿种植田、兰州北滨河路绿化带苜蓿绿化带中苜蓿病毒病的发生情况进行调查，每样点调查5个样方，每个样方面积为0.5 m2，每个样方调查10株，共50株，记录所调查苜蓿植株发病数，并计算发病率及病情指数。然后将具有明显症状的苜蓿病叶采集并装入无菌塑料袋带回实验室，每种症状的病叶采集3份，将其中一份短时间保存于4 ℃冰箱、一份保存于-20 ℃冰箱，将另外一份于-70 ℃冰箱长时间保存，最后移回一部分苜蓿病株于实验室内，并种植于防虫网室内。

表1　苜蓿病毒病分级标准Table 1　Alfalfa virus disease classification standard

1.2苜蓿病毒病症状类型

于2015年5月-6月分别在甘肃农业大学校园、皋兰县、景泰县以及兰州北滨河路绿化带等苜蓿种植区采集的病样，进行症状类型归类记载。

1.3苜蓿病毒病病原种类检测

采用双抗体夹心法(Double Antibody Sandwich ELISA，DAS-ELISA)对从甘肃农业大学苜蓿试验田、皋兰县及景泰县苜蓿苜蓿种植田、兰州北滨河路绿化带苜蓿绿化带采集的表现为皱缩、花叶、花叶皱缩、黄斑花叶等症状的32份苜蓿病毒病病叶，进行AMV、WCMV、BYMV和CPMV的带毒情况检测，统计不同病样的带毒率以及不同病毒的检出率。具体检测方法按天根生化科技(北京)有限公司提供的AMV、WCMV、BYMV和CPMV的DAS-ELISA试剂盒试验步骤进行测定，每个样品重复3次；用ELX800型酶联免疫测定仪(Bio-Tek厂家产品)，分别测定450 nm下各孔的A值，并按照样品的A值≥临界值者为阳性(+)带毒；样品A值<临界值为阴性(-)不带毒的标准，判断样品是否带毒，临界值(CUT OFF)=阴性对照A平均值+0.15。并按下式计算病毒的检出率及复合侵染率。

1.4苜蓿病毒病病原提纯及寄主范围测定

以田间采集的苜蓿病毒病样(-70 ℃保存)为试材，分别对苜蓿花叶病毒(AMV)、菜豆黄花叶病毒(BYMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、白三叶花叶病毒(WCMV)进行提纯[16,18,23-25]，将提纯的病毒保存于-20 ℃，备用。

供试寄主植物：挑选籽粒饱满的苋色藜(Chenopodiumamaranticolor)、心叶烟(Nicotianaglutinosa)、普通烟(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopersiconesculentum)、辣椒(Capsicumannuum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、菜豆(Phusvolusvulguris)、豇豆(Vignasinensis)、苜蓿(Medicagosativa)、黄豆(Glycinemax)、豌豆(Pisumsativum)、莴苣(Lactucasativa)、向日葵(Helianthusannuus)、黄瓜(Cucumissativus)、千日红(Comphrenaglobosa)、鸡冠花(Celosiacritata)、大白菜(Brassicapekinensis)等植物种子，消毒催芽后，种植于营养钵(直径15 cm×高10 cm)中，并置于防虫网室内，每种植物种植25盆，每盆3株；待幼苗长至2～3叶期时，采用摩擦接种法[26]分别将提纯的AMV、WCMV、BYMV、CPMV及这4种病毒按1∶1∶1∶1混合物与磷酸缓冲液(pH=7.0)按1∶4混合，然后接种于黑暗处理12 h的幼苗叶片上，每种病毒接种5盆，以接种磷酸缓冲液为对照，将接种处理幼苗置于防虫网室中，逐日观察寄主植物发病情况。

1.5数据分析

采用SPSS 19.0软件对所测数据统计分析，用“平均值±标准误”表示测定结果，采用Excel 2010制作三线表。

2结果与分析

2.1苜蓿病毒病田间发病情况

通过对甘肃农业大学苜蓿试验田、皋兰县及景泰县苜蓿种植田、兰州北滨河路绿化带苜蓿种植区病毒病发生情况调查，发现随着苜蓿种植年限的增长，苜蓿病毒病的发病率和发病指数均升高，其中皋兰县8年龄的苜蓿病毒病发病率和病情指数最高，分别为43.33%和26.08，而甘肃农业大学2年龄的苜蓿病毒病最低，为16.08%和6.25，其它两个地区的发病率和病情指数都介于二者之间，所调查地区的平均发病率和发病指数分别为32.15%和16.27；方差分析表明，不同种植年限的苜蓿病毒病病情指数之间存在极显著差异(P<0.01)(表2)。

2.2田间症状类型

在经过田间实地调查之后发现，病毒病原感染苜蓿后主要有以下几种症状类型(图1)。皱缩：叶片扭曲皱缩，叶片还尚未变色并且叶片不能展平，呈直立状态(症状代号为SH，图1A)；卷叶矮化：沿叶片主脉，整个叶片沿叶边缘向下卷起，并呈卷筒状、叶片褪绿、叶尖变钝；或者叶片不能完全展开(症状代号为LR，图1B)；皱缩褪绿：叶片扭曲皱缩，叶片逐渐由心叶向植株下部褪绿(症状代号为SHCH，图1C)；斑驳花叶：沿着叶脉两侧有黄绿相间的花叶形成，或者在叶片局部有黄绿斑点(症状代号为MOM，图1D)；花叶皱缩：沿叶脉产生褪绿条点，叶片扭曲皱缩，叶片逐渐由心叶向植株下部褪绿(症状代号为MOSH，图1E)；黄斑花叶：沿主叶脉产生褪绿相间条点，连接起来为褪绿黄条

表2　甘肃省兰州市苜蓿病毒病发病情况Table 2　Incidence of alfalfa virus disease in Lanzhou City, Gansu Province

注：同列不同小写、大写字母分别代表0.05和0.01水平上差异显著。

Note: Diffierent lower case and capital letters represent significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively.

图1　苜蓿病毒病田间症状类型Fig.1　Symptom types of alfalfa virus disease in the field

注：A,皱缩；B,卷叶矮化；C,皱缩褪绿；D,斑驳花叶；E,花叶皱缩；F,黄斑花叶；G,丛簇矮化；H,黄化；CK,健康。

Note:A, shrinkage; B, leaf roll dwarfing; C, shrinkage chlorosis; D, mottle mosaic; E, mosaic shrinkage; F, macular mosaic; G, rosetting stunt; H, etiolation; CK, healthy.

斑，并形成黄色条纹或不标准的花叶(症状代号为MAMO，图1F)；丛簇矮化：顶部叶片皱缩不能正常展平，有的叶片沿叶脉扭曲坏死，整个植株矮化严重(症状代号为ROST，图1G)；黄化：顶部叶片完全黄化变得黄亮色，叶脉也被黄化(症状代号为ET，图1H)。

2.3苜蓿病毒病病原种类检测

通过采用DAS-ELISA对4种症状类型30份苜蓿病样病毒病原带毒情况检测，结果表明,不同症状类型的病叶病毒病原种类有一定差异，其中图1B和图1E的病样中检出了AMV、BYMV、CPMV和WCMV 4种病毒，带毒率都为100.00%；图1A的病样以AMV和BYMV为主，带毒率为50.00%；图1F以AMV、BYMV和CPMV为主，带毒率为75.00%(表3)。

通过对AMV、WCMV、BYMV、CPMV四种病毒的检检测结果统计分析发现，它们的检出率分别为100%、50.00%、75.00%、75.00%，并发现这4种病毒存在着复合侵染的现象，其中AMV和WCMV，AMV和BYMV，AMV和CPMV，WCMV和BYMV，WCMV和CPMV，BYMV和CPMV，AMV、WCMV和BYMV，AMV、WCMV和CPMV，AMV、BYMV和CPMV，WCMV、BYMV和CPMV及4种病毒的复合侵染率分别为50.00%，100.00%，75.00%，50.00%，50.00%，75.00%，50.00%，50.00%，75.00%，50.00%及50.00%(表3)。

表3　苜蓿病毒病原DAS-ELISA检测结果Table 3　Detection of the alfalfa viral pathogens by DAS-ELISA

注：(+)为阳性反应；(-)为阴性反应。

Note：(+) means positive reaction;(-) means negative reaction.

2.4寄主范围测定

通过寄主范围测定和接种寄主DAS-ELISA检测发现，AMV可侵染心叶烟、普通烟、番茄、辣椒、马铃薯、苋色藜、菜豆、豇豆、黄豆、苜蓿、豌豆、向日葵、鸡冠花、千日红、黄瓜共6科15种植物；WCMV可侵染心叶烟、苋色藜、菜豆、豇豆、黄豆、苜蓿、豌豆、黄瓜共4科8种植物；BYMV和CPMV可侵染苋色藜、菜豆、豇豆、黄豆、苜蓿、豌豆、黄瓜共3科7种植物；AMV、WCMV、BYMV、CPMV四种病毒混合液可复合侵染心叶烟、普通烟、马铃薯、苋色藜、黄豆、向日葵、鸡冠花、辣椒、豌豆、菜豆、豇豆、苜蓿、番茄、黄瓜共6科14种植物，且症状表现不同。其中AMV、WCMV、BYMV、CPMV均可侵染黄瓜、大豆、豌豆、苋色藜、豌豆、菜豆和豇豆，且接种后黄瓜接种叶出现黄绿斑点；大豆、豌豆、苋色藜叶片出现局部枯斑；豌豆叶片出现局部枯斑、植株萎蔫；菜豆和豇豆叶片呈现局部褐色病斑，苜蓿表现花叶皱缩；除此以外AMV还可侵染心叶烟、普通烟和向日葵、千日红、鸡冠花，分别出现系统花叶和局部枯斑等症状；WCMV、BYMV、CPMV不侵染番茄、辣椒、马铃薯、向日葵、千日红、鸡冠花、莴苣、白菜等植物。

AMV、WCMV、BYMV、CPMV病毒按1∶1∶1∶1混合接种后，心叶烟、普通烟叶片为系统花叶，辣椒、番茄接种叶为枯斑，心叶畸形；马铃薯、苋色藜、黄豆、向日葵、鸡冠花为局部枯斑；菜豆、豇豆接种叶片为局部褐色枯斑；豌豆为局部枯斑、植株萎蔫；苜蓿为花叶皱缩且叶片发黄；黄瓜为黄绿斑点；4种病毒混合液不能侵染莴苣、千日红、大白菜 (表4、表5)；其中紫花苜蓿接种AMV后，其症状为部分叶片呈花叶，且叶片边缘发黄；接种WCMV后其症状为部分叶片变小，叶片褪绿，并有黄色斑点产生；接种BYMV后其症状为部分叶片皱缩，且叶边缘稍向上卷起；接种CPMV后其症状为部分叶片皱缩，叶片有褪绿现象发生，而同时接种4种病毒后，苜蓿部分叶片皱缩，花叶且叶片发黄，并伴有植株矮化现象发生(图2)。

表4　AMV、WCMV、BYMV、CPMV及4种病毒混合液寄主范围及症状类型Table 4　The host plant of AMV,WCMV,BYMV,CPMV and mixture of four kinds of virus and symptoms

3讨论与结论

通过对甘肃农业大学苜蓿试验田、皋兰县及景泰县苜蓿种植田、兰州北滨河路绿化带苜蓿种植区苜蓿病毒病症状表现和发病情况调查，发现在调查区苜蓿病毒病普遍发生，平均发病率和病情指数分别为32.15%和16.27；且随着苜蓿种植年限的增长呈上升趋势；苜蓿病毒病症状表现复杂多样，可归纳为皱缩、卷叶、皱缩褪绿、斑驳花叶、花叶皱缩、黄斑花叶、丛簇矮化、黄化8种，花叶型和花叶皱缩型较为普遍，占58.65%。DAS-ELISA检测发现AMV、WCMV、BYMV、CPMV是引起兰州市苜蓿病毒病的病原；其中AMV为主要病原，其检出率为100%，其余3种病毒的检出率均在66.67%以上；4种病毒的复合侵染率为40.74%。这与已报道的AMV、CPMV为苜蓿病毒病病原的结果相一致[14,16,21-22]。寄主范围测定发现,侵染苜蓿的AMV、WCMV、BYMV和CPMV均可侵染豆科、藜科、葫芦科的植物，4种病毒混合液可复合侵染豆科、茄科、藜科、葫芦科、菊科、苋科的植物。除此之外AMV还可侵染茄科和菊科的植物，WCMV可侵染茄科的植物。

表5　AMV、WCMV、BYMV、CPMV及病毒复合侵染寄主DAS-ELISA检测Table 5　The result of AMV,WCMV,BYMV,CPMV and mixed virus infection hosts detected by DAS-ELISA

注：(+)为阳性反应；(-)为阴性反应。 Note：(+) means positive reaction；(-) means negative reaction.

图2　苜蓿接种AMV、WCMV、BYMV、CPMV的症状反应Fig.2　The symptom reaction of alfalfa was inoculated with AMV,WCMV,BYMV,CPMV

据报道，侵染苜蓿的病毒有10多种[9-13]，蚜虫、叶蝉、飞虱、蓟马和白粉虱均可传播植物病毒，田间调查中发现，蓟马是危害紫花苜蓿的主要害虫，可加重苜蓿病毒病症状表现。吴永敷等[27]研究认为,蓟马危害症状与苜蓿病毒病的症状是有所区别的，蓟马危害的叶片不但皱缩，而且中下部两侧向内卷曲；而病毒病的叶片只皱缩，两侧不向内卷曲，且对着太阳观察，叶片上有黄色的花斑；丛簇矮化症状表现与刘涛等[28]研究发现的苜蓿丛枝病症状表现相似，如严重矮化、叶片皱缩、变小，叶片褪绿等。而本研究仅对AMV、WCMV、BYMV和CPMV这4种病毒进行了检测和寄主范围测定，对于蓟马和其它昆虫能否传播苜蓿病毒病原以及表现为丛簇矮化症状的病样是否含有支原体等问题还有待于进一步探讨。

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(责任编辑武艳培)

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0652

*收稿日期：2015-11-23接受日期：2016-02-24

基金项目：草业生态系统教育部重点实验室开放课题(CYZS-2011006)；甘肃省财政厅项目(甘财教2013(116))

通信作者：梁巧兰(1968-)，女，甘肃崇信人，副教授，博士，主要从事作物保护和生物防治研究。E-mail：liangql@gsau.edu.cn

中图分类号：S435.4

文献标志码：A

文章编号：1001-0629(2016)7-1297-09*

Corresponding author:Liang Qiao-lanE-mail：liangql@gsau.edu.cn

Symptoms and pathogen detection of alfalfa virus disease

Zhou Qi-yu, Liang Qiao-lan, Han Liang

(College of Grassland Science of Gansu Agricultural University, Key Laboratory of Grassland Ecosystem of MOE, Sino-U.S. Centers for Grazing Land Ecosystem Sustainability, Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province, Lanzhou 730070, China)

Abstract:In order to investigate the symptoms, pathogen and host range of alfalfa virus diseases in Lanzhou City, Gansu Province, alfalfa virus diseases were investigated in field and pathogens were tested by DAS-ELISA. The results showed that the viral disease of alfalfa widely spread in Anning District and Gaolan County of Lanzhou and Jingtai County of Baiyin City and the highest incidence and disease index were 43.33% and 26.08, respectively, which were in Jingtai. A total of 90 sample were collected and 30 of them were detected which brought the detection ratio of 30%. Alfalfa mosaic virus (AMV), white clover mosaic virus(WCMV), bean yellow mosaic virus (BYMV) and cowpea mosaic virus (CPMV) were main viral pathogen which had detection rates of 100.00%, 50.00%, 75.00%, 75.00%, respectively, and their mixed infection rate of 50.00%. There were 6 families, 17 genera and 18 species for host range testing. AMV can infect 6 families, 15 species, WCMV can infect 4 families, 8 species, BYMV and CPMV could infect 3 families, 7 species, and four kinds of virus could co-infect 6 families, 14 species of plants.

Key words:alfalfa; virus diseases; symptoms of type; host range

周其宇，梁巧兰，韩亮.紫花苜蓿病毒病症状类型及病原检测.草业科学,2016,33(7)：1297-1305.

Zhou Q Y,Liang Q L,Han L.Symptoms and pathogen detection of alfalfa virus disease.Pratacultural Science,2016,33(7)：1297-1305.

第一作者：周其宇(1988-)，男，甘肃榆中人，在读硕士生，主要从事植物保护研究。E-mail：zhouqiyu251725@foxmail.com