外用伤科药对运动性慢性骨骼肌损伤及肌细胞IL-6表达影响研究

牛文玉，陈佑学



外用伤科药对运动性慢性骨骼肌损伤及肌细胞IL-6表达影响研究

牛文玉1，陈佑学2

1.铜仁学院体育与健康学院，贵州 铜仁554300;2.首都体育学院，北京 100191

摘要：目的：研究不同外用伤科药对运动性骨骼肌慢性损伤中肌细胞IL-6表达的影响以及骨骼肌细胞中IL-6在运动性慢性肌组织损伤修复中所发挥的作用。方法：采用体重2.2kg—2.5kg成年雄性新西兰兔42只，随机分为对照组、扶他林组、消痛贴组，每组21只。其中每组又分为4、5周组，每组7只。动物采用高电压低电流刺激仪刺激，使其产生主动的跑跳运动，训练方案：0.1-0.2s/次(每两次间隔12s),20min/组(两组间歇20min)，3组/天，5天/周。训练结束后分别给4周、5周扶他林组和消痛贴组以不同的外用药。各组在相应的训练周(4、5)完成后取左腿腓肠肌内侧头，用4%多聚甲醛固定液保存，进行HE染色及免疫组织化学处理，光镜观察肌组织形态变化及细胞中IL-6表达的免疫组织化学图像分析，计算IL-6平均光密度值。结果：1、随着训练时间的推移，骨骼肌细胞IL-6的表达明显增多；2、外用伤科药可以降低运动性慢性骨骼肌损伤中细胞的炎症因子；3、外用伤科药可以显著降低运动性慢性骨骼肌损伤中肌细胞IL-6的表达。结论：1、骨骼肌损伤中，肌细胞的炎性因子与肌细胞IL-6的表达存在一定的联系；2、外用伤科药对慢性骨骼肌损伤中肌细胞的修复有着较明显的作用；3、运动性慢性骨骼肌损伤中，不同的外用伤科药都可以显著降低骨骼肌IL-6的表达影，二者没有显著差别。

关键词：IL-6表达；外用贴药；作用；运动性肌损伤

IL-6(白细胞介素-6)主要由T细胞、B细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、单核细胞和组织中巨噬细胞所分泌，能够提高机体非特异性免疫功能，在炎症反应中起作用的细胞因子，多年来对于IL-6的研究一直在进行。近来很多研究发现，IL-6与运动以及运动引发的骨骼肌组织损伤存在密切的联系[1-3]。运动量、运动项目、运动强度的不同可以引起血浆中IL-6的表达发生不同的变化。IL-6还可以能在一定程度上反映出骨骼肌组织微细结构的变化，所以将其作为观察骨骼肌损伤的一个评定指标[4]。

外用消痛贴的主要成分是独一味、水柏枝等中药材。临床多次证明，消痛贴在慢性软组织损伤的治疗中有着较为明显的作用[5-7]。扶他林软膏的主要组成是双氯芬酸纳,属非甾体类抗炎类药物,有研究证实外用扶他林膏对于炎症的减轻有着明显的作用。因此，探讨二者在运动性骨骼肌慢性损伤中与肌细胞IL-6之间的相互作用和关系，为IL-6新的应用做基础性的理论建设。

1材料与方法

1.1实验对象和分组

实验对象为体重在2.2kg—2.5kg间成年雄性新西兰兔42只，购自北京科宇动物养殖中心，实验动物许可证号：SCKK2009-0005,在中国中医科学研究院基础理论研究所实验动物中心，按照国家标准的兔饲养常规分笼饲养。所有动物随机分为对照组(n=21)、外用扶他林组(n=21)和外用消痛贴组(n=21),其中每组分别为4、5周组，分组如下：

表1　具体分组情况

1.2运动方案

动物的训练在中国中医科学研究院中医理论研究所动物房进行，依据有关研究运动性骨骼肌损伤的造模方法以及有关文献和预实验确定运动方案，采用高压低流电刺激仪刺激实验组动物，使其产生跑跳运动，具体方案如下：

每只动物每隔12秒刺激一次，每次刺激时间持续0.1-0.2秒，每天训练60分钟，分3次进行，两次训练间隔20分钟。每只兔子每天跑跳约300次，每周连续训练5天，每天的训练的开始时间不变。在训练过程中观察记录动物每天的精神状态、体重变化、进食情况，检查是否受伤等。

1.3给药

将外用消痛贴组和扶他林组中4、5周组动物小腿部位毛发剔除，将消痛贴和扶他林软膏均匀涂抹于该皮肤处，并用纱布缠裹。给药在每天训练结束后进行，每日一次，下次训练前将药包拆除。

1.4取材

分别在第4、5周训练结束后，使用空气栓塞法处死动物后立刻取动物左腿腓肠肌内测头，分两块置入4%多聚甲醛固定液中进行固定。

1.5肌组织HE染色、观察

将所取标本分别进行常规HE染色处理，并在光镜下观察肌细胞、肌细胞核、肌内衣、肌外衣、炎症细胞等，采用奥林巴斯数码显微镜进行拍照。

1.6免疫组化标本制作及图像分析

制作免疫组标本，并采用奥林巴斯D3.2图像处理软件对片子图像进行采集，在判定肌细胞IL-6的表达中：棕褐色的区域为表达区，密度的深度、面积与IL-6的表达量呈正相关；

1.7数据处理

随机取免疫组化图像5个不同的视野记录，使用MIAS4.0对所采图像进行分析(平均光密度值)，得出组织图片IL-6表达的平均光密度值。采用SPSS17.0软件对所结果进行处理，用均值±标准差(X±s)表示。不同用药组间横向比较采用单因素方差分析法进行(a=0.05)。

2结果

2.1肌细胞形态学比较(光学镜)

2.1.1横向比较4周组

4周对照组：细胞间结缔组织增生，细胞染色不均，出现红染，细胞核肿胀，巨噬细胞进出现在坏死、变性或结构被破坏的肌细胞中(图1)。

图2　( HE,横切,400倍镜)

图3　(HE,横切,400倍镜)

4周扶他林组：呈现单相多灶性炎性细胞浸润，核固缩明显，细胞排列较为整齐，染色不均，有颗粒性变性(图2)。4周消痛贴组：有较少的炎性细胞，未见明显的炎性细胞浸润灶，细胞排列较为整齐、致密，染色均匀(图3)。

2.1.2横向比较5周组

图4　(HE,横切,400倍镜)

图5　(HE,横切,400倍镜)

图6　(HE,横切,400倍镜)

5周对照组：出现大量的炎性细胞浸润灶，细胞核肿胀，细胞间隙开始变得模糊不清，细胞肿胀呈现圆形，炎性细胞侵入坏死细胞内，细胞内出现的免疫细胞，细胞变性坏死，结够不完整(图4)。相比之下，5周消痛贴、扶他林组有较少的炎性细胞，未见明显的炎性细胞浸润灶，细胞排列较为整齐、致密，染色均匀(图5、6)。

2.2骨骼肌细胞IL-6免疫组织化学图像分析

2.2.1纵向比较4、5周对照组中不同用药组肌细胞IL-6平均光密度值的变化

表1　4、5周对照组IL-6平均光密度值横向比较

*:与4周照组比较P<0.05

研究结果显示，与4周对照组比较5周对照组肌细胞IL-6平均光密度值显著升高(p<0.05)。随着训练时间的推移，骨骼肌细胞IL-6的表达明显增多。

2.2.2横向比较4周组中不同用药组肌细胞IL-6平均光密度值的变化

表2　4周各组IL-6平均光密度值横向比较

*:与对照组比较P<0.05 #:与4周扶他林组比较P>0.05

研究结果显示，与4周对照组相比较，4周扶他林组、消痛贴组肌细胞IL-6的平均光密度值较低，且存在显著性差异(P<0.05)；与4周扶他林组相比较，4周消痛贴组的肌细胞IL-6平均光密度值无明显差异(P>0.05)。不同外用伤科药在以降低慢性骨骼肌损伤中肌细胞IL-6的表达有相同影响，都可以降低其表达。

2.2.3横向比较5周各组肌细胞IL-6平均光密度值的变化

表3　5周各组IL-6平均光密度值横向比较

*:与5周对照组比较P<0.01 #:与5周扶他林组比较P>0.05

与5周对照组相比较，5周扶他林组、消痛贴组肌细胞IL-6的平均光密度值较低，且存在显著性差异(P<0.05)；与5周扶他林组相比较，5周消痛贴组肌细胞IL-6平均光密度值无明显差异(P>0.05)。在运动性慢性骨骼损伤中，外用伤科药对肌细胞IL-6的表达有降低作用。

3讨论

3.1不同外用药对骨骼肌形态学变化的影响

外用消痛贴主要的药学是多种中药成份组成，在消除、减轻局部炎症反应，促进受损组织修复方面有着明显的作用。加之其所采用的药贴技术，可以将药物直接覆于受损肌组织，外用效果明显。外用消痛贴外在急性软组织损伤中有着明显的作用，这与局部受损组织的炎症反应有关。扶他林软膏的主要组成是双氯芬酸纳,属非甾体类抗炎类药物,有研究证实外用扶他林膏对于减轻细胞炎症反应有着明显的作用。通过研究同表明，通过对比外用贴药和外用扶他林发现二者有着相似的药用价值。

运动性骨骼肌慢性损伤中，不同的外用药对不同组别肌细胞有着较为明显的影响。观察对比用各对照组(4、5周)和各给药组的肌组织切片，发现：与对照组相比较，扶他林组和消痛贴药组都有着各自变化的特点。对照组可看到明显的肌纤维坏死、变性，多发生变性，坏死，肌纤维异染，泡体溶解。从组织中可观察到机化了的瘢痕组织，坏死肌细胞增多，大量巨噬细胞浸润、侵入坏死肌细胞，提示肌细胞结构受到破坏，受损程度较为严重。扶他林组和外用贴药组炎性细胞较为减少。这与高杨等人的研究结果是相吻合的，外用消痛贴对于局部的炎症有着抑制作用[5]。

3.2不同外用药对运动性骨骼肌慢性损伤中肌细胞IL-6的表达影响

从纵向来看，5周对照组肌细胞IL-6的表达，明显高于4周训练组，结合肌组织形态学的观察结果可知，随着训练时间的延长，骨骼肌细胞损伤中的炎症在增多，同时肌细胞IL-6的表达也在增多。这也就是说运动性慢性骨骼肌细胞损伤中肌细胞IL-6的表达与肌细胞炎症反应存在一定的联系。从不同用药组横向比较的结果来看，与对照组相比较，消痛贴组、扶他林组肌细胞IL-6的表达值有着显著性差异。就说明在用药2周后，扶他林组和消痛贴组相似的效果，都能够降低肌细胞IL-6的表达水平。

扶他林软膏的主要组成是双氯芬酸纳,属非甾体类抗炎类药物,有研究证实外用扶他林膏对于炎症的减轻有着明显的作用。消痛贴主要的药学成分是独一味等多种中药成份，在消除、减轻局部炎症反应，促进受损组织将复有着明显的作用。加之其所采用的要贴技术，可以将药物直接覆于受损肌组织，外用效果明显。临床上外用消痛贴对各种急、慢性软组织损伤都有着较为明显的疗效[8-10]。李敏、何朝永等2008年的研究中，以周istar大鼠作为实验对象，采用自制撞击器造成动物急性软组织损伤，分别给以不同组别的动物不同的药，通过对比外用消痛贴组和随机模型对照组动物血浆中TNF-α、IL-1βmRNA表达水平后发现，外用消痛贴组动物血浆中TNF-α、IL-1βmRNA较随机模型组低，进而得出：外用消痛贴治疗急性软组织损伤的机制可能是通过抑制炎症因子IL-1β和TNF-α表达来发挥其抗炎作用[11]。本研究通过光镜观察组织的形态学变化，可发现外用消痛贴对于运动性骨骼肌慢性损伤也有着较为明显的疗效。

在运动性骨骼肌慢性损伤中，IL-6在肌细胞中的表达机制还不甚明了，在运动性损伤中的作用也存在着较多的疑问。运动性骨骼肌损伤中，短期(2周)的外用伤科药对于骨骼肌IL-6的表达有着影响，对运动性骨骼肌慢性损伤有着一定的疗效。

4结论

(1)骨骼肌损伤中，肌细胞的炎性因子与肌细胞IL-6的表达存在一定的联系；

(2)外用伤科药对慢性骨骼肌损伤中肌细胞的修复有着较明显的作用；

(3)运动性慢性骨骼肌损伤中，不同外用伤科药(扶他林与消痛贴)都可以显著降低骨骼肌IL-6的表达影，二者没有显著差别。

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第一作者简介：牛文玉(1985-)，男，山西吕梁人，讲师，硕士，研究方向：体育保健康复理论与应用。

中图分类号：

文献标识码：A

文章编号：1005-0256(2016)07-0147-4

doi:10.19379/j.cnki.issn.1005-0256.2016.07.060

Research on The Influence of External Applied Medicine to Exercise-Induced Chronic Skeletal Muscle Injuries and Muscle Cells IL-6 Expression

Niu Wenyu1,Chen Youxue2

Abstract:The thesis aims at discussing the influence of different external applied medicine to muscle cells IL-6 expression in exercise-induced chronic skeletal muscle injuries, as well as the role IL-6 played in exercise-induced skeletal muscleinjury rehabilitation. Methods: Randomly divide 42 adult male New Zealand rabbits weighted from 2.2kg to 2.5kg into 3 groups—control group,voltaren group and pain-relieving paste group, with 7 rabbits per group. And each group is divided into 4-week group and 5-week group. High voltage and low current stimulation is used to stimulate the rabbits to run and jump actively. Training schedule:0.1-0.2s per time with 12s intervals, 20min per set with 20min intervals between sets, 3 sets per day and 5 days a week. After training, use different medicine for voltaren group and pain-relieving paste group (both 4-week and 5-week groups) . Inside muscle heads of left leg gastrocnemius muscles are sampled when the training week finished, preservedin 4% paraformaldehyde and treated with HE dyeing and immunochemistry. Then the change of organelle’s tissue and immunochemical analysis on IL-6 image in cells are observed under light microscope to counts the IL-6average optical density value. Results are as follows：First, inflammatory factors are related with muscle sell IL-6 expression in skeletal muscle injuries. Second, external applied medicine is significantlyeffective for chronic skeletal muscle damage. Third, no significant differences between different external medicines in reducing skeletal sell IL-6 expression.

Key words:IL-6expression; external applied medicine; effect; exercise-induced muscle damage

College of Sport and Health, Tongren University, Tongren 554300, Guizhou,China.