联合稀土元素镧和铈对雄性大鼠生殖功能影响的实验研究

邓洋 张丽萍 高艳荣 李斌振 卢城德 邢广雪

联合稀土元素镧和铈对雄性大鼠生殖功能影响的实验研究

邓洋 张丽萍 高艳荣 李斌振 卢城德 邢广雪

目的研究稀土元素镧和铈对大鼠生殖功能的影响，初步探讨联合镧和铈对大鼠生精功能的损伤程度。方法将大鼠随机分成La(NO3)3、Ce(NO3)3及La(NO3)3＋Ce(NO3)3作用的高、中、低三个剂量组，并设对照组，灌胃稀土元素和生理盐水8周后，检测附睾精子的数量、存活率及畸形率，分析睾丸中ACP、AKP、LDH及NOS酶活性的改变和睾丸组织病理学改变。结果①各给药剂量组(除低剂量Ce组外)睾丸的AKP均低于对照组(P＜0.05)；低剂量La＋Ce组的ACP高于对照组(P＜0.05)，高La＋Ce、中La和高Ce剂量组的ACP均低于对照组(P＜0.05)；高中低La＋Ce、低La、高中Ce剂量组的LDH均低于对照组(P＜0.05)；高中La＋Ce、高低La、高低Ce剂量组的NOS均低于对照组(P＜0.05)。②高中剂量组的La、Ce及La＋Ce精子数量均少于对照组(P＜0.05)；高中La、中Ce、高La＋Ce剂量组精子活率显著低于对照组(P＜0.05)；高La、高中Ce、高中La＋Ce剂量组精子畸形率均高于对照组(P＜0.05)。③光镜下整体上看高剂量镧、铈及联合组对睾丸组织破坏严重，低剂量组与对照组相比破坏较少或无明显影响。结论高剂量的镧、铈及镧+铈对大鼠生精功能造成了一定损伤，随着剂量的降低损伤越来越不明显；镧与铈联合作用表现为相加作用，后呈现协同作用。

镧；铈；联合；精子

我国是世界上稀土资源最丰富的国家，我国的稀土储量、生产和出口均为全球之冠，稀土应用也居世界第二。由于稀土具有独特的结构和性能，因而广泛用于农、林、牧、渔、医、药等方面。由于应用的广泛、半衰期长等性质，越来越多的稀土元素进入环境，它对人体健康和生态环境的潜在危害已经引起广泛关注。学者建议系统的研究稀土对人类健康的影响，在接触人群中早期发现毒效应并迅速采取干预措施，从而使毒效应发生可逆变化而不发展为显著的功能损伤，同时研究稀土元素及其化合物的毒作用靶器官及机制，并制定稀土职业接触限值。所以明确稀土元素的生物毒性，制定出各种稀土元素职业接触限值对于职业人群是迫切需要解决的问题。目前，关于稀土元素的研究主要集中于呼吸系统[1-2]、消化系统、血液系统及免疫系统等方面研究[3-4]，尚缺乏稀土元素尤其是稀土间的联合作用对生殖系统损伤的系统研究。稀土元素镧和铈资源丰富、易提取，而且比其他稀土产品便宜，因此它们就成为较早有实际用途的稀土，它们对生殖方面的研究主要集中在雌性生殖系统和胚胎，而关于它们对雄性生殖系统的影响较少。因此，本研究通过将不同剂量的硝酸镧[La(NO3)3，La]、硝酸铈[Ce(NO3)3，Ce]及硝酸镧＋硝酸铈(La＋Ce)对实验大鼠给药，通过检测精子数量和质量、睾丸相应酶活性变化及睾丸组织病理学改变，初步揭示稀土元素镧、铈及镧＋铈联合作用的生殖毒性，为职业人群接触镧和铈等稀土物质的安全性的评价积累依据和资料，并为探讨其作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及给药方法由北京市实验动物中心提供的雄性Wister大鼠100只，初始体质量(200±20)g，清洁级动物。合格证书：SCXK(京)2011—0012。硝酸镧(批号：2014-9-10)和硝酸铈(批号：2014-168E02)均购于瑞科稀土冶金及功能材料国家工程研究中心。大鼠按体质量随机分组法分成10组(空白对照组，La、Ce及La＋Ce分别高、中、低剂量组)，每组10只，分笼饲养，大鼠自由饮水及饮食。按大鼠体质量给予相关的稀土元素和生理盐水灌胃，具体如下：高、中、低La、Ce及La＋Ce剂量组给药分别为：100、50、25，20、10、5，50＋10、25＋5、12.5＋2.5(上述给药剂量单位均为mg/kg BW)；空白对照组为生理盐水1 mg/kg剂量。

1.2 观察指标

1.2.1 大鼠附睾精子数量和质量的测定先称重附睾，置附睾于6 mL生理盐水中，用剪刀剪碎，用4层擦镜纸过滤，取滤液1 mL，加入9 mL生理盐水，制备精子悬液，将精子悬液置液在37℃水浴中孵育20 min，待用。

1.2.1.1 精子计数取1滴精子悬液滴到细胞计数板上，于显微镜下计数5个方格的精子数将精子数换算成每克附睾中的精子数。

1.2.1.2 精子活率取1滴精子悬液，加入1滴5%伊红溶液和1%苯胺黑溶液于载玻片的一端，迅速混匀，取上述混匀液1滴制成抹片，镜下检查，活的精子头部为无色透明，死亡精子为粉红色。观察200个精子，计数活精子数，计算精子活率。

1.2.1.3 精子畸形取1滴精子悬液涂片，使用甲醇固定5 min，干燥后，用1%伊红染色1 h，蒸馏水冲洗，待片子晾干后镜检，精子畸形主要包括双头、胖头、无钩、双尾、无定形等，每只大鼠检测1 000个精子，计算畸形率。

1.2.2 睾丸细胞酶活性的影响含量取左侧睾丸组织0.5 g加入4.5 mL冷生理盐水，冰浴制成10%的匀浆，以3 500 r/min离心10 min，取上清液，采用酶联免疫法测定睾丸匀浆中碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)、酸性磷酸酶(Acid phopohatase，ACP)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)和一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)的含量。

1.2.3 睾丸组织的病理学检查取左侧睾丸用10%中性缓冲福尔马林液固定，采用HE染色，对睾丸进行组织病理学检查，分析大鼠睾丸组织损伤特征。

1.3 统计学方法所有数据采用SPSS 17.0软件进行分析，使用单因素方差分析和SNK-Q检验比较组间差异，计量资料用均数±标准差(±s)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体质量、睾丸重量、脏器系数的比较不同给药剂量La＋Ce、La及Ce对大鼠体质量、睾丸重量及睾丸与体质量的脏器系数比差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 大鼠睾丸细胞酶活性测定与对照组相比，除了低剂量Ce组外，其余实验组大鼠睾丸AKP活性均低于对照组(P＜0.05，图1A)。低剂量La＋Ce组ACP高于对照组，高剂量La＋Ce、中剂量La和高剂量Ce的ACP均低于对照组(P＜0.05，图1B)；高中低剂量La＋Ce，低剂量La，高中剂量Ce的LDH均低于对照组(P＜0.05，图1C)；高中剂量La＋Ce，高中剂量La，高低剂量Ce的NOS均低于对照组(P＜0.05，图1D)。

2.3 稀土元素镧和铈对大鼠精子数量、活率及畸形率的影响高剂量La＋Ce、La及Ce组与对照组相比均存在精子数量减少(P＜0.05)，精子活率显著降低(P＜0.05)，精子畸形率明显升高(P＜0.05)。通过上述结果显示随着镧和铈给药剂量增加，与对照组相比出现精子数量和精子活率下降，畸形率升高的趋势。对于镧和铈联合组显示的毒副作用较单独的稀土元素并没有大大增加，所以推断的二者是相加作用，而不是拮抗作用或相乘作用(表1)。

图1 实验大鼠睾丸中四种酶的活性比较

表1 稀土元素镧和铈联合对大鼠精子数量、精子活率、精子畸形率的影响(±s)

表1 稀土元素镧和铈联合对大鼠精子数量、精子活率、精子畸形率的影响(±s)

注：与对照组比较，#P＜0.05；与同一种低剂量染毒物质的组相比，△P＜0.05

组别n精子数量(×106/g)精子活率(%)精子畸形率(%)空白对照组10375.88±13.2393.30±8.10*2.34±0.56*La(NO3)3高10238.38±7.43#82.45±11.50#4.23±1.34#中10272.10±12.49#84.30±14.72#3.76±0.97低10295.77±6.1985.60±8.142.98±0.34 Ce(NO3)3高10224.90±6.22#△88.56±9.145.98±1.23#△中10280.13±23.07#81.00±17.08#4.12±1.36#低10361.60±34.7286.67±8.922.90±1.02 La＋Ce高10232.40±30.32#81.20±12.55#4.78±0.45#△中10286.08±62.30#84.10±7.31#3.89±1.67#低10358.13±3.8585.40±10.772.67±0.69

2.4 睾丸组织形态学观察光镜下对照组睾丸的曲细精管排列整齐，各级生精细胞均层次清晰，发育良好，支持细胞有条理的分布在生精细胞之间，间质细胞群集或散落在睾丸间质之间，管腔内有大量精子；与对照组相比，高剂量La组可以看到曲细精管上皮细胞几乎消失，剩下基底膜和少量精原细胞，整个曲细精管内无精子，管腔破裂，管壁出现萎缩与变形，间质细胞和支持细胞较少，间质间隙变宽、渗出液增多；与对照组相比，中低La剂量组生精细胞较高剂量组多，虽然也出现管壁变形与萎缩，间质间隙增大，但管腔完整无破裂现象发生；与对照组相比，高剂量Ce组管腔虽无破裂但曲细精管上皮细胞消失，仅剩下基底膜和少量精原细胞，整个曲细精管内无精子，中、低剂量组情况也稍好一些；与对照组相比，高剂量La＋Ce组也可以看到曲细精管上皮细胞几乎消失，仅剩下基底膜和少量精原细胞，整个曲细精管内无精子，管壁出现萎缩与变形，间质细胞和支持细胞变少，间质间隙变宽、渗出液增多(图2)。

图2 镧和铈对大鼠睾丸组织的病理学改变(HE染色×200)

3 讨论

研究表明稀土元素能有效提高牲畜的体质量和品质，稀土曾被广泛用于饲料添加剂[5]。本研究中实验组大鼠体质量与对照组相比差异无统计学意义，可推测低剂量的镧和铈对动物的生长发育有促进作用，但是高剂量可抑制动物生长，甚至会产生毒害作用。

精原细胞的发生、发展、分化为成熟精子是一个精细且复杂的过程，任何一个环节受到外源性有害物质的影响都有可能会引起精子的数量和质量的下降，而这些外源性有害物质对雄性生殖系统毒性效应主要表现在精子生成障碍和形态学的改变。精子质量是评价雄性生育力的重要指标，可通过精子数量、活率及畸形率体现[6]。精子数量如果发生减少通常认为是外源性化学物质对某级甚至是各级生精细胞生长发育过程中产生毒性作用的结果；精子活率是预测生育能力最重要的指标之一且为受精的前提和保证。本结果显示，与对照组相比，高给药剂量组大鼠精子的数量和质量显著下降，由此推测镧和铈无论是单独作用还是联合作用对精子质量均有一定影响，剂量越大，损害越大。沈旭等[7]提出精子活力下降可能是由于稀土离子可取代某些酶的Ca2+、Mg2+，而阻碍了Ca2+进入细胞膜的相关位点，一些重要的代谢途径尤其是能量的代谢途径被抑制了，如3′，5′-环磷酸腺苷，阻碍了精子运动的启动过程及其鞭毛的摆动，导致精子活力下降，其机制还有待于进一步研究[8]。

此外，精子形成过程中需要睾丸中多种酶参与，AKP是存在于胞浆的一种含锌酶，与生精细胞的分裂及营养运输密切相关，本实验中AKP的活力下降，影响细胞的分裂周期，导致各级精母细胞及精子均减少；ACP主要存在于睾丸支持细胞和精子的溶酶体内，目前认为其能够清除衰老和受损的细胞，维持细胞正常的代谢和功能，是评价生精障碍的指标之一[8]，研究显示ACP活力越低，头部异常精子比例就越高[9]。本结果表明染毒剂量越大，ACP下降的越明显，说明随着染毒剂量的增大生精过程变得越来越难；给予镧的三组大鼠，睾丸ACP、AKP与对照组相比均有下降趋势，这与陈言峰等[10]的研究结果有所不同，但与刘高峰等[11]的结果是一致的，这可能与实验条件不同有关。在本试验中睾丸组织的LDH活力均出现下降，推测镧和铈可能干扰了睾丸细胞糖代谢从而导致睾丸细胞代谢异常，进而影响了精子的形成。NOS可催化L-精氨酸合成一氧化氮(Nitric oxide，NO)，雄性动物生殖系统中的NO水平与雄激素分泌、阴茎勃起、精子成熟、运动、获能及睾丸微循环的调节均有密切关系[11-13]。本研究结果表明给药后，NOS呈现下降趋势，这样生成的NO也将出现下降，影响生殖细胞的产生和功能。

本研究中初步探讨了镧铈联合作用对大鼠生殖功能的影响，虽然给药剂量分别是镧和铈剂量的50%，但从无论是精子的数量和质量、4种酶及光镜的结果来看，联合作用的高剂量组所造成的损害作用并没有大大超过镧和铈单独作用的结果，故推测镧铈联合其体现的是相加作用，后呈协同作用。相应的机制会在以后的实验中作进一步的研究与探讨。

4 结论

通过给大鼠连续灌胃不同浓度稀土元素镧、铈及镧铈联合8周后，不同剂量的稀土元素对大鼠生殖系统有不同程度的影响，即低剂量无作用或促进作用、高剂量有损害作用，镧铈联合其体现的是相加作用，后呈协同作用。

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ObjectiveTo study the influence of combined rare earth elements of Lanthanum and Cerium on reproductive function of male rats，and to make preliminary discovery of the damage degree of combined Lanthanum and Cerium to spermatogenous function of the rats.MethodsThe male rats were randomly divided into group La(NO3)3，group Ce(NO3)3and group La(NO3)3＋Ce(NO3)3with three different dosage of high，moderate and low，and a control group was set up.After 8 weeks of gavage of rare earth elements and normal saline，the epididymal sperm number，survival rate and aberration rate were detected to analyze the changes of ACP，AKP，LDH，and NOS enzymatic activity，and the pathological alteration of testicular tissues.Results①The testicular AKP in the different dosage groups except the low Ce group was lower than that of the control group(P＜0.05)；The ACP of the low La＋Ce group was higher than that of the control group(P＜0.05)；The ACP of the high La＋Ce group，the moderate La group and the high Ce group was lower than that of the control group(P＜0.05)；The LDH of the high，moderate and low La＋Ce groups，of the low La group，and of the high and moderate Ce groups was lower than that of the control group(P＜0.05)；The NOS of the high and moderate La＋Ce groups，of the high and low La groups and of the high and low Ce groups was lower than that of the control group(P＜0.05).②The number of the sperms in the high and moderate groups of La，Ce and La＋Ce was smaller than that of the control group(P＜0.05)；The sperm motility rate in the high and moderate La，moderate Ce，and high La＋Ce groups was significantly lower than that of the control group(P＜0.05)；The sperm aberration rate of the high La，high and moderate Ce，and high and moderate La＋Ce groups was higher than that of the control group(P＜0.05).③Generally，under the light microscope，the damage effects of high dose of La，Ce，and La＋Ce on testicular tissues were serious，while between the control group and the low dose groups，there was little damage or or no obvious effect.ConclusionHigh dosage of La，Ce，and La＋Ce shows damage to the spermatogenous function of the rats，while it shows no clear damage with the decrease of the dosage.Combined rare earth elements of Lanthanum and Cerium has additive effect and then takes on synergistic effect.

Lanthanum；Cerium；Combine；Sperm

2016-05-04)

1005-619X(2016)10-1012-04

10.13517/j.cnki.ccm.2016.10.002

014010包头医学院(邓洋，张丽萍，高艳荣，卢城德，刑广雪)；014010包头市卫生局卫生监督所(李斌振)

1.包头市医药卫生科技计划项目(Wsjj2014016，稀土元素镧和铈联合作用对雄性大鼠生殖毒性影响的研究)；2.内蒙古自治区自然基金(2015MS0865，稀土元素铈和钕联合对雄性大鼠免疫和内分泌系统影响的实验研究)；3.秦文彬科技教育基金(byjj201508，稀土元素镧和铈联合对雄性大鼠免疫系统和肝功能影响的实验研究)

张丽萍