针灸对环磷酰胺化疗小鼠血清中IL-7和IL-18含量的影响

刘海伟,路玫,曹大明,于冬冬,滕迎春(.湖北中医药大学,武汉 430065;.河南中医学院,郑州 450046)

针灸对环磷酰胺化疗小鼠血清中IL-7和IL-18含量的影响

刘海伟1,路玫2,曹大明2,于冬冬1,滕迎春1
(1.湖北中医药大学,武汉 430065;2.河南中医学院,郑州 450046)

目的通过观察针灸治疗前后环磷酰胺(CTX)化疗模型小鼠血清中白介素-7(IL-7)和白介素-18(IL-18)含量的变化,探讨针灸改善化疗后所导致免疫抑制的分子生物学机制。方法选用清洁级昆明种雄性小鼠80只,按体重随机分为空白组、模型组、针刺组、艾灸组,每组20只。除空白组外,其余各组均腹腔注射CTX制备小鼠骨髓抑制模型。针刺组和艾灸组选取大椎、膈俞、肾俞、足三里进行针刺和艾灸治疗,空白组、模型组每日陪同抓取和固定,不做任何治疗。依次经过治疗后3 d和5 d,在每组中分两次分别处死10只小鼠,摘眼球取血,采用ELISA法检测血清中IL-7和IL-18的含量。结果治疗3 d至5 d,针刺组和艾灸组白细胞均开始回升,且针刺组疗效优于艾灸组;在3 d组和5 d组中,针刺组和艾灸组血清中IL-7含量均高于模型组(P＜0.05),且针刺组疗效优于艾灸组(P＜0.05);在3 d组和5 d组中,针刺组和艾灸组血清中IL-18含量均高于模型组(P＜0.05),且在5 d组中,针刺组疗效优于艾灸组(P＜0.05)。结论针刺和艾灸可以明显上调CTX化疗小鼠血清中IL-7、IL-18的含量,减轻CTX引起的免疫抑制,提高机体的免疫功能。

针灸疗法;白细胞介素7;白细胞介素18;环磷酰胺;免疫;小鼠

[Abstract]ObjectiveTodiscuss the molecular biological mechanismof acupuncture and moxibustion inimproving immunosuppression due to chemotherapy,by observing the effect of acupuncture and moxibustion on the serum contents of interleukin(IL)-7 and IL-18 in m ice undergone chemotherapy with Cyclophosphamide(CTX).M ethodEighty SPF male Kunm ing ricewere random ized into ablank controlgroup,amodel group,an acupuncturegroup,and amoxibustion group according to the weight,20 m ice in each group.A ll of the groups except the blank control received intraperitoneal injection with CTX to prepare themousemodel ofmyelosuppression.The acupuncture group and moxibustion group respectively received acupuncture andmoxibustion intervention at Dazhui(GV14),Geshu(BL17),Shenshu(BL23)and Zusanli(ST36),while the blank control group and model group were only treated with grasping and fixing.Respectively after 3-day and 5-day interventions,10mice from each group were sacrificed each time to collect blood via removing eyeballs,and the enzyme linked immunosorbentassay(ELISA)was used to exam ine the serum contents of IL-7 and IL-18.ResultAfter 3-day and 5-day interventions,the white blood cells increased in both acupunctureandmoxibustion groups,and the efficacy of theacupuncture groupwasmore significant than that of the moxibustion group;despite 3-day intervention or 5-day intervention,the serum contents of IL-7 in both acupuncture andmoxibustion groupswere significantly higher than that in themodel group(P＜0.05),and the efficacy of the acupuncture group wasmore significant than that of themoxibustion group(P＜0.05);after 3-day and 5-day interventions,the serum contents of IL-18 in both acupunctureandmoxibustion groupswere significantly higher than that in themodel group(P＜0.05),and theefficacy of the acupuncture group wasmore significant than thatof themoxibustion group after 5-day intervention(P＜0.05).Conclusion Acupuncture and moxibustion can significantly up-regulate the serum contents of IL-7 and IL-18 in m ice undergone CTX chemotherapy,m itigate immunosuppression caused by CTX,and improve immune function of thebody.

[Key w ords]Acupuncture-moxibustion;IL-7;IL-18;CTX;Immune;Mice

烷化剂环磷酰胺(Cyc lophosphamide,CTX)为广谱抗肿瘤药物之一,在临床中常用于恶性肿瘤的药物治疗,由于其特异性选择不高,在杀伤肿瘤细胞的同时,也可对机体的正常细胞造成破坏,产生免疫抑制,造成机体免疫力低下,最终导致化疗失败。本实验研究通过腹腔注射CTX制备小鼠骨髓抑制模型,观察CTX化疗小鼠血清中IL-7、IL-18的含量为评价指标。为针灸大椎、膈俞、肾俞、足三里缓解恶性肿瘤患者应用CTX药物治疗所致的免疫抑制提供科学的理论依据和实验依据,探讨针灸增强CTX小鼠免疫功能的作用和机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

80只雄性清洁级昆明种(KM)小鼠,体重(20±2)g,按清洁级进行饲养,由郑州大学医学院提供,实验动物使用许可证号为SCXK(豫)2010-0002。

1.2主要实验仪器

超净工作台、薄片离心机SHANDON、电子天平、小鼠固定板(自制)、鼠夹、华佗牌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司生产)、特制美容艾条(河南南阳卧龙艾绒厂生产)等。

1.3实验试剂

环磷酰胺注射液(山西普德药业有限公司生产,批号为04120501);生理盐水注射液(山东鲁抗辰欣药业有限公司,批号为120412107);小鼠IL-7检测试剂盒(河南华豫教学实验仪器用品营销部提供,批号为CK-E20125M);小鼠IL-18检测试剂盒(河南华豫教学实验仪器用品营销部提供,批号为CK-E11385M);过氧化物酶(HRP);四甲基联苯胺(TMB);冰乙酸溶液;蒸馏水。

1.4动物分组

取80只雄性KM小鼠,按体重编号后用随机数字表随机分出空白组20只,其余统一造模后,再用上述方法分为模型组、针刺组、艾灸组,每组20只。

1.5造模

参照《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》(中华人民共和国卫生部药政局编)的造模方法[1],腹腔注射CTX 100 mg/kg/d(即依据小鼠体重0.02 mL/g用药量,腹腔注射浓度为5 mg/mLCTX溶液),分别在首次注射药物的24 h、48 h再次注射CTX溶液,连续3 d,停药后4 h造模成功(依据CTX药代动力学过程,4 h后即失去活性)[2]。空白组小鼠腹腔注射同等剂量的0.9%生理盐水,连续3 d。

1.6选穴及治疗方法

选取大椎、膈俞、肾俞、足三里。小鼠穴位定位参考《中国兽医针灸学》,并模拟大鼠穴位定位法,大椎位于背部正中,第7颈椎与第1胸椎之间;膈俞位于第7胸椎下两旁,肋间,左右各分布一穴;肾俞在第2腰椎下两旁,左右各分布一穴;足三里位于小鼠后肢膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处,左右各分布一穴。

针刺组:按照各组造模时间的先后顺序,在造模完成(第3次小鼠腹腔注射CTX)4 h后针刺治疗,各组小鼠配对同时进行操作。用华佗牌美容毫针,采用管式进针法直刺,进针深度为3 mm,留针6 min。每日1次。

艾灸组:按照各组造模时间的先后顺序,在造模完成4 h后开始艾灸治疗,各组小鼠配对同时进行。用美容细艾条点燃后,在距离穴位皮肤2 cm处固定悬灸3 min。每日1次。

空白组和模型组:每日陪同针刺组、艾灸组抓取和固定,不做任何治疗。

各组连续治疗5 d。

1.7观察指标及方法

1.7.1取材方法

从首次CTX造模第1天起,每天在相同时间固定专人对各组小鼠进行割尾静脉采血,每只取10mL,分别滴入事先预备好的390mL3%冰乙酸稀释液试管中,将试管中的血样本摇匀后,用玻璃棒蘸取少量血样本从盖玻片边缘滴入细胞计数板上,人工镜检外周血白细胞总数。在造模成功后,每天相同时间进行针刺或艾灸治疗,治疗3 d后,次日以颈椎脱臼法随机处死每组10只小鼠,摘其眼球,取血液于冻存管中,置于3500 r/min的离心机中离心10 min,用移液器取上清液于EP管中,放置于﹣80冰箱中保存。治疗5 d后,次日以颈椎脱臼法处死每组剩余10只小鼠,操作方法同上。

1.7.2ELISA法检测CTX小鼠血清中IL-7和IL-18含量的表达

采用比色法测定血清中IL-7和IL-18的含量,具体操作严格按照试剂盒说明书进行。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.8统计学方法

数据分析采用SPSS16.0统计分析软件。计量资料以均数±标准差表示,统计采用单因素方差分析,按a=0.05标准进行检验,用Levene法进行方差齐性检验,若方差齐,两两比较采用LSD法;若方差不齐,两两比较采用Tamhane法。

2　结果

2.1针灸对CTX化疗小鼠外周血白细胞计数动态变化的影响

表1结果显示,小鼠腹腔注射CTX后第2天、第3天外周血白细胞逐渐下降,与空白组比较,模型组、针刺组、艾灸组白细胞均降低,有显著性差异(P＜0.01);与模型组比较,针刺组、艾灸组白细胞计数无显著性差异(P＞0.05)。表明化疗药物CTX具有明显的抑制骨髓功能,损伤造血细胞的毒副反应。针刺、艾灸进行干预之后,与模型组比较,针刺组和艾灸组可使CTX化疗小鼠白细胞提前1天回升(在第3天)并提前1天超过基础水平(在第5天)。在第3天,针刺组与艾灸组均开始回升,针刺组疗效优于艾灸组,且针刺组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05);尤其在第4～5天针刺组、艾灸组白细胞均明显升高,表明针灸确有减轻CTX化疗小鼠骨髓抑制,提升白细胞的作用。针刺与艾灸两种方法比较无显著性差异,但针刺疗效优于艾灸。表明针灸改善化疗后骨髓抑制,升高白细胞的疗效是确切的,其疗效随着治疗次数的增加而增加,具有积极的治疗意义。

表1　针灸对CTX化疗小鼠外周血白细胞计数动态变化的影响(治疗3 d以前n=20;治疗3 d以后n=10)　(±s,109/L)

表1　针灸对CTX化疗小鼠外周血白细胞计数动态变化的影响(治疗3 d以前n=20;治疗3 d以后n=10)　(±s,109/L)

注:与空白组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别　　造模1 d　　造模2 d　　造模3 d　　治疗1 d　　治疗2 d　　治疗3 d　　治疗4 d　　治疗5 d空白组　8.56±2.36　10.05±1.79　6.28±2.03　7.32±2.11　7.84±2.11　8.29±0.95　9.85±1.80　10.92±0.94模型组　6.48±1.97　5.14±2.361)　2.85±1.111)　1.41±0.561)　1.49±0.551)　0.76±0.291)　4.35±0.821)　7.70±1.57针刺组　6.86±3.57　4.35±1.601)　2.16±0.721)　1.28±0.311)　1.01±0.251)　2.48±2.271)2)　6.95±2.83　12.56±7.16艾灸组　7.01±1.60　4.51±0.731)　2.30±0.331)　1.14±0.261)　1.26±0.271)　2.01±0.361)　6.10±0.911)2)　11.50±3.30

由图1动态变化折线图分析可知,在治疗第3天,针刺组和艾灸组白细胞计数均开始回升,在治疗第5 天,针刺组和艾灸组白细胞计数回升高于空白组白细胞计数,达到峰值。

图1　针灸对CTX化疗小鼠外周血白细胞计数动态变化折线图(±s,109/L)

2.2针灸对CTX化疗小鼠血清中IL-7含量的影响

表2结果显示在实验中治疗3 d与治疗5 d,空白组含量高于模型组,且有统计学意义(P＜0.05),说明了烷化剂CTX具有免疫损伤和免疫抑制的毒副反应;针刺组在分别治疗3 d和5 d后,IL-7含量均高于模型组,且有统计学意义(P＜0.05),说明针刺治疗可以提高CTX化疗小鼠血清中IL-7的含量;艾灸组与模型组对比差异有统计学意义(P＜0.05),说明艾灸可以提高CTX化疗小鼠血清中IL-7的含量;针刺组和艾灸组IL-7含量均高于模型组,且有统计学意义(P＜0.05),说明对CTX小鼠进行针刺和艾灸治疗后IL-7的含量均高于模型组;针刺组IL-7的含量高于艾灸组,经过3 d 和5 d治疗两组间差异有统计学意义(P＜0.05),并且通过本实验证实,在提高IL-7含量的疗效趋势中,针刺的疗效要优于艾灸的疗效。

表2　针刺与艾灸对CTX化疗小鼠血清中IL-7含量的影响(±s,pg/mL)

注:与空白组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与针刺组比较3)P ＜0.05

组别　n　3 d组　5 d组空白组　10　104.27±7.74　109.39±8.15模型组　10　70.81±11.631)　70.44±5.101)针刺组　10　94.03±6.901)2)　86.65±4.061)2)艾灸组　10　80.56±4.231)　80.62±3.671)3)

2.3针刺与艾灸对CTX化疗小鼠血清中IL-18含量的影响

表3　针刺与艾灸对CTX化疗小鼠血清中IL-18含量的影响(±s,pg/mL)

表3　针刺与艾灸对CTX化疗小鼠血清中IL-18含量的影响(±s,pg/mL)

注:与空白组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与针刺组比较3)P ＜0.05

组别　n　3 d组　5 d组空白组　10　82.55±13.78　96.58±8.75模型组　10　46.57±8.351)　41.69±12.021)针刺组　10　74.05±13.772)　91.29±9.102)艾灸组　10　69.01±9.411)3)　76.24±6.201)2)3)

3　讨论

现代医学恶性肿瘤治疗方法中,化疗为主要的手段和方法之一。化疗药物在靶向杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长和扩散的同时,在不同程度对正常细胞进行杀伤,继而出现白细胞减少和骨髓抑制等毒副反应。烷化剂CTX作为主要的化疗药物之一,具有抑制机体骨髓功能、减少白细胞数量的毒副反应。中医学中将“骨髓抑制”“白细胞减少”等归入“虚劳”范畴。多由机体正气不足,复感化疗外来“毒邪”,伤及正气,导致气血化源不足,肝肾精血亏虚,“毒邪”与气血搏击,脏腑气血失调,而发为本病。

本实验穴组根据“虚则补之”“劳则温之”的原则,选取大椎、膈俞、肾俞、足三里,通过针刺与艾灸,以达调补气血、健脾益肾、填精益髓之功效。大椎位于督脉,为诸阳之会,可振奋机体阳气;膈俞为背部腧穴,为血之会,具有理气养血、活血化瘀之功效;肾俞为背俞穴,具有补益肾气、滋阴养肾、填精益髓之功效;足三里为胃之下合穴,具有调理脾胃、补益气血之功效[3]。四穴合用,不仅补益先天之本,还可补益后天之本,具有补血活血、温通阳气、通而不滞的作用[4]。

白细胞介素-7(IL-7)是由骨髓基质细胞、胸腺基质细胞和脾细胞所产生的细胞因子,其主要功能为刺激免疫细胞T细胞、B细胞前体细胞生长,能促进骨髓组织的生成[5],具有广泛的免疫效应[6]。IL-7具有抗肿瘤免疫反应调节作用[7]。潘德顺等[8]研究发现,IL-7基因转染人舌鳞癌细胞株,具有明显的抑瘤作用,机制可能为IL-7降低肿瘤细胞产生的抑制免疫因子,增强NK细胞的活性,并促进淋巴细胞增殖。钟惠珍等[9]研究证实,IL-7在腹水中的含量要高于血清,并且IL-7具有抗肿瘤作用。本实验研究结果证实,CTX化疗小鼠血清中IL-7的含量在3 d组和5 d组中,空白组IL-7含量均高于模型组,说明烷化剂CTX对小鼠的免疫细胞T细胞、B细胞有抑制作用,从而抑制其免疫功能。针刺组和艾灸组IL-7的含量在3 d组和5 d组中均高于模型组,表明经过针刺和艾灸治疗后,可以不同程度地解除CTX对小鼠的免疫细胞T细胞、B细胞的抑制作用和对免疫效应及功能的影响。同时,3 d组和5 d组研究结果证实,针刺组疗效优于艾灸组。说明经过针刺和艾灸治疗后,均可以提高血清IL-7的含量及促进抗肿瘤免疫功能,但是针刺的疗效要明显优于艾灸的疗效。

白细胞介素-18(IL-18)为巨噬细胞、DC、角质细胞所产生的细胞因子,其主要功能为促进Th1分化、刺激T细胞产生干扰素、增强NK细胞活性[10]。近年来研究结果显示,IL-18具有抑制肿瘤血管生成和肿瘤的发生作用[11],还具有抗肿瘤免疫方面的重要价值[12]。徐玢等[13]研究发现IL-18有显著抗白血病作用,其基因可修饰瘤苗。IL-18促进Th1细胞发育,产生抗肿瘤效应[14]。IL-18在小鼠实体瘤均具有显著抗肿瘤免疫效应[15]。徐英萍等[16]研究证实,IL-18基因修饰的肿瘤细胞,可增强机体的抗肿瘤免疫反应。本实验研究结果证实,CTX化疗小鼠血清中IL-18的含量在3 d组和5 d组中,空白组IL-18含量均高于模型组,说明烷化剂CTX对小鼠有抑制免疫细胞活性的作用,从而抑制其免疫功能。针刺组和艾灸组IL-18的含量在3 d组和5 d组中均高于模型组,表明经过针刺和艾灸治疗后,可以不同程度地解除CTX对小鼠的免疫细胞活性的抑制作用和对免疫效应及功能的影响。同时,经过针刺和艾灸治疗后,还可以提高抗肿瘤的免疫效应。研究结果证实,在5 d组CTX化疗小鼠血清中IL-18的含量比较,针刺组疗效优于艾灸组。说明经过针刺和艾灸治疗后,均可以促进免疫功能的恢复。且随着治疗时间的累积,针刺的疗效明显优于艾灸。

综上所述,通过对CTX化疗小鼠进行针刺和艾灸干预后,均可以提高CTX化疗小鼠血清中IL-7和IL-18的含量,进而可以缓解被CTX所致的免疫抑制,同时,还可以促进免疫细胞的生长,促使其免疫活性的发挥,促进免疫功能和免疫效应的发挥,在一定程度可以提高抗肿瘤的免疫效应。因此,针刺和艾灸治疗可以提高烷化剂CTX化疗所致的毒副反应,提高化疗的成功率和肿瘤患者的生存质量。

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Effect of Acupuncture and Moxibustion on Serum IL-7 and IL-18 Contents in Mice Undergone Chemotherapy with

LIU Hai-wei1,LU Mei2,CAO Da-ming2,YU Dong-dong1,TENG Ying-chun1.1.HubeiUniversity ofChinese Medicine,Wuhan 430065,China;2.Henan University ofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou 450046,China

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.02.0223

1005-0957(2016)02-0223-04Cyclophospham ide

国家自然科学基金项目(81072884)

刘海伟(1984-),男,2013级博士生

路玫(1958-),女,教授

2015-05-12