穴位埋线对癫痫大鼠海马神经元细胞凋亡及氨基酸的影响

金泽,曹晓婷,王春英,王玉琳,陈静(.黑龙江中医药大学附属第二医院,哈尔滨 5000;.黑龙江中医药大学,哈尔滨 50040)

穴位埋线对癫痫大鼠海马神经元细胞凋亡及氨基酸的影响

金泽1,曹晓婷2,王春英1,王玉琳1,陈静1
(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040)

目的探讨穴位埋线对癫痫大鼠海马神经元氨基酸及细胞凋亡的影响。方法选取50只Wistar大鼠,每组10 只,随机分为空白对照组、模型组、穴位埋线组、针刺组、丙戊酸钠组。除空白对照组外,其他4组均用青霉素钠腹腔注射造模,穴位埋线组第1、4、7天重复埋线。第7天模型组、穴位埋线组、针刺组及丙戊酸钠组再一次腹腔注射青霉素钠点燃模型大鼠,所有动物均在第7天治疗后断头取脑,剥离海马。标本切片观察各组大鼠海马神经元形态学改变(原位末端标记法)。并检测海马内谷氨酸(Glu)、g-氨基丁酸(GABA)的含量(高效液相色谱仪),计算GABA/Glu比值。结果空白对照组大鼠海马神经元细胞正常,阳性凋亡细胞稀疏,模型组、针刺组、穴位埋线组及丙戊酸钠组均可见不同程度海马细胞凋亡现象。与模型组相比,穴位埋线组、针刺组及丙戊酸钠组海马细胞凋亡现象明显降低(P＜0.01),丙戊酸钠组低于穴位埋线组(P＜0.05),穴位埋线组低于针刺组(P＜0.05)。模型组海马区兴奋性氨基酸Glu的含量较空白对照组明显增加(P＜0.01),穴位埋线组、针刺组及丙戊酸钠组与模型组对比海马内Glu的含量明显减少(P＜0.01),且穴位埋线组及丙戊酸钠组Glu水平少于针刺组(P ＜0.05),穴位埋线组及丙戊酸钠组间无明显差异(P＞0.05)。模型组海马区GABA的含量低于空白对照组(P＜0.01)。穴位埋线组、针刺组及丙戊酸钠组GABA的含量均高于模型组(P＜0.01),穴位埋线组、丙戊酸钠组及针刺组间GABA含量无明显差异(P＞0.05)。模型组GABA/Glu比值低于空白对照组(P＜0.01),穴位埋线组、针刺组、丙戊酸钠组GABA/Glu比值高于空白对照组(P＜0.01),穴位埋线组、丙戊酸钠组及针刺组间GABA/Glu比值无明显差异(P＞0.05)。结论重复穴位埋线可明显阻止癫痫大鼠海马神经元细胞凋亡的发生发展并可通过调节脑内兴奋性与抑制性氨基酸的水平而发挥抗癫痫作用。

穴位疗法;埋线;癫痫;海马;细胞凋亡;氨基酸;大鼠

[Abstract]Ob jectiveTo investigate theeffectof acupointcatgutembedding on hippocampalneuronalamino acidsand apoptosis in epilepsy rats.M ethodFiftyWistar ratswere random ized into blank control,model,acupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups,10 rats each.Amodelwasmade by intraperitoneal injection of penicillin in all thegroupsexcept theblank controlgroup.Catgutembedding was repeated in the acupoint catgutembedding group at day 1,4 and 7.At day 7,penicillin was intraperitoneally injected again to ignitemodel rats in theacupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproate groups.A ll the animalswere decapitated at day 7 to take the brain and separate the hippocampus.The specimen was sliced to observe morphological changes in hippocam pal neurons(in situ end labeling techniques).Hippocam pal glutam ic acid(Glu)and g-aminobutyric acid(GABA)contentswerealsomeasured(high performance liquid chromatography).The ratio of CABA/Gluwas calculated.ResultHippocampal neuronswere normaland apoptosis-positive cellswere sparse in theblank control group of rats. Differentdegreesof hippocampal apoptosiswere seen in themodel,acupoint catgutembedding,acupuncture and sodium valproate groups.Hippocampal apoptosis reduced significantly in theacupoint catgutembedding,acupunctureand sodium valproate groups compared with themodel group(P＜0.01).It decreasedmore in the sodium valproate group compared with the acupoint catgut embedding group(P＞0.05)and did in the acupoint catgut embedding group compared with the acupuncture group(P＞0.05). Hippocampalexcitatory am ino acid Glu content increased significantly in themodelgroup comparedwith theblank controlgroup(P ＜0.01)and decreased significantly in the acupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups comparedwith the model group(P＜0.01).G lu levelswere low er in the acupoint catgut embedding and sodium valp roate groups than in the acupuncture group(P＞0.05)and therewas no significant differencebetween theacupointcatgutembedding and sodium valproate groups(P＞0.05).HippocampalGABA contentwas lower in themodelgroup than in the blank controlgroup(P＜0.01)and higher in the acupoint catgut embedding,acupuncture and sodium valproate groups than in themodel group(P＜0.01).Therewas no significant difference in theGABA contentbetween the acupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups(P＞0.05).The ratio of CABA/Glu was lower in themodel group than in theblank controlgroup(P＜0.01)and higher in the acupoint catgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups than in the blank control group(P＜0.01).Therewasno significant difference in the ratio of CABA/Glu between theacupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproate groups(P＞0.05).ConclusionRepeated acupointcatgutembedding can obviously prevent theoccurrence and developmentof hippocampal neuronal apoptosis in epilepsy rats.Itproducesan antiepileptic effectby regulating excitatory and inhibitory am ino acid levels.

[Keywords]Acupoint therapy;Catgutembedding;Epilepsy;Hippocampus;Apoptosis;Amino acid;Rats

癫痫(epilepsy)是一种临床常见、反复发作的慢性脑部疾病,病因复杂,临床表现多样,病程缠绵难愈。有学者发现癫痫患者30%～70%存在认知功能障碍[1-7]。目前,癫痫还没有特效的治疗方法,主要采用抗癫痫西药来控制癫痫发作。现代临床实践提示穴位埋线治疗癫痫效果较好[8-14]。笔者通过青霉素钠腹腔注射法,建立大鼠癫痫模型,通过观察癫痫大鼠海马神经元细胞凋亡及海马内神经递质谷氨酸(Glu)、g-氨基丁酸(GABA)的影响及GABA/Glu比值来探究穴位埋线对癫痫的可能作用机制。

1　材料与方法

1.1动物与分组

成年健康雄性Wistar大鼠50只,体重200～250 g(由黑龙江中医药大学实验动物中心提供,许可证号为黑动字P00102004),常规适应性喂养1星期后开始进行实验,随机分为空白对照组、模型组、穴位埋线组、针刺组、丙戊酸钠组,每组10只。

1.2药物及试剂

丙戊酸钠(200 mg/片),注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂,160万U/支),灭菌注射用水(天津药业焦作有限公司,2mL/支)。氨基酸标准品购自美国Sigma公司,用0.1mol/LHCL配制成0.5mmol/L标准贮备液,标准应用液是以0.1 mol/LHCL将贮备液稀释3倍。邻苯二甲醛(OPA)为Sigma公司产品,B-巯基乙醇为国产分析纯试剂。所有实验用超纯水系自备3次石英蒸馏水。衍生试剂,10 mgOPA溶于0.5 mL甲醇中,加b-巯基乙醇30mL与0.4 mol/L硼酸缓冲液(pH9.4)至4.5 mL即成。

溶液配制:丙戊酸钠,取200mg丙戊酸钠,研细末,加蒸馏水至10 mL,配成20 mg/mL浓度,灌胃。青霉素钠,取青霉素钠160万U,加灭菌注射用水2mL配成570 万U/mL。

1.3大鼠癫痫模型造模方法

通过参考文献[15-16]介绍及预实验的方法,除空白对照组外,其余4组用微量注射器将青霉素钠通过腹腔注射入大鼠体内,青霉素钠剂量为570万U/kg,参考Racine R[17]标准,判断大鼠是否出现癫痫状态(Ⅰ级为口角和面部抽动;Ⅱ级为Ⅰ级＋点头;Ⅲ级为Ⅱ级＋前肢阵挛;Ⅳ级为Ⅲ级＋后腿站立;Ⅴ级为Ⅳ级＋跌倒;以大鼠出现Ⅳ～Ⅴ级发作,且持续20 min为造模成功)。

1.4治疗方法

1.4.1空白对照组

腹腔注射与模型组同等剂量的生理盐水,常规喂养7 d。

1.4.2模型组

青霉素钠致癫痫大鼠,常规喂养。

1.4.3针刺组

青霉素钠致痫后,以乙醚吸人麻醉后固定,参照《实验针灸学》[18],选取大鼠百会、长强穴,用0.35mm ×25mm毫针针刺10mm,行平补平泻手法,每次30min,每隔10 min行针1次,每日针1次,治疗7 d。

1.4.4穴位埋线组

青霉素钠致痫后,采用0.5 mm羊肠线在百会、长强穴穴位埋线10 mm,分别在1 d、4 d、7 d重复埋线。

1.4.5丙戊酸钠组

青霉素钠致痫后行丙戊酸钠灌胃,每日2次,灌7 d。剂量为成人每天15 mg/kg(体重)按体表面积换算成大鼠。

第7天除空白对照组外其他4组均再行一次青霉素钠腹腔注射(同造模方法一样)使模型大鼠痫性放电,然后进行治疗之后处死取材。

1.5观测指标

所有动物均在7 d治疗后,立即处死。乙醚麻醉,后用40 g/L多聚甲醛心脏灌注以固定,断头取脑,在冰盘上迅速开颅取脑组织,切除脑干及小脑,沿正中矢状面切开大脑,剥离海马,称质量后于﹣80℃低温保存待测。

1.5.1大鼠海马神经元形态学改变及细胞凋亡指数比较观察

标本常规脱水、浸蜡、包埋后冠状连续石蜡切片经苏木精-伊红染色光镜下观察各组大鼠海马神经元形态学改变。

原位末端标记法(Tunel)检测大鼠海马神经元DNA片段化的情况。本实验采用半定量法检测细胞凋亡指数,反映凋亡细胞DNA片段化情况。细胞核中有紫或深蓝褐色颗粒者为阳性染色细胞。每张切片计数3个不同视野(×400)内的阳性细胞数,取平均数作为细胞凋亡指数。神经元细胞凋亡情况,用原位细胞凋亡检测法染色的切片中,细胞核中有紫或深蓝褐色颗粒者为阳性染色细胞(即凋亡细胞)。

1.5.2大鼠海马氨基酸测定

取解冻后的海马,用电子天平称重,加l mL无水乙醇,在冰浴下超声破碎制成匀浆液,4℃低温离心(12000 rpm,10 min)。取该上清液10mL加100mL衍生试剂混匀,反应1～2 min后进样。并采用高效液相色荧光法进行检测。检测海马内谷氨酸(Glu)、g-氨基丁酸(GABA)的含量,并计算GABA/Glu比值。得到的结果换算成mmol/g湿重。仪器:LC-6A型液相色谱仪(日本岛津公司),SCL-6A系统控制器,CTO-6A柱温箱,RF-10AXL荧光检测器;TGL-16C离心机;ER-18A型电子天平(日本)。

色谱条件:采用Nova-PakC18柱(4.6mm×150mm, 5mm)色谱柱;柱温35℃;流动相为50 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH6.8)、甲醇和四氢呋喃(A液82:17:1,B液22:77:1),流速为1 mL/min,进样量为20mL,荧光检测器激发波长为338 nm,发射波长为425 nm。

1.6统计学方法

数据采用统计分析软件SPSS17.0进行统计处理。计量资料用均数±标准差表示,比较采用方差分析。

2　结果

模型组2只大鼠及丙戊酸那组1只大鼠在第7日青霉素钠点燃时抽搐过度死亡。其中,除空白对照组外,模型组发作持续时间为(182±15.6)s,穴位埋线组、丙戊酸钠组及针刺组发作时间分别为(69±9.6)s, (64.8±11.2)s,(90±8.1)s;模 型 组 潜 伏 期 为(12.3±2.3)min,穴位埋线组、丙戊酸钠组及针刺组潜伏 期 分 别 为 (25.3±4.2)min,(30.3±2.9)min, (25±2.9)min,3组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01),说明穴位埋线、丙戊酸钠及针刺都对癫痫有改善作用。

2.1各组大鼠细胞凋亡指数比较

空白对照组阳性染色细胞稀疏(见图1),模型组阳性染色细胞多且密集(见图1),穴位埋线组(见图1)、丙戊酸钠组(见图1)和针刺组(见图1)中阳性染色细胞少于模型组但多于空白对照组。比值详见图2。

图1　各组阳性染色细胞

由图2可知,模型组阳性染色细胞明显多于空白对照组(P＜0.01),穴位埋线组、针刺组及丙戊酸钠组海马细胞凋亡现象明显低于模型组(P＜0.01),丙戊酸钠组低于穴位埋线组(P＜0.05),穴位埋线组低于针刺组(P＜0.05)。

图2　各组大鼠海马细胞凋亡指数(±s)

2.2各组大鼠海马氨基酸含量的比较

由图3可知,模型组Glu含量较空白对照组多,且与空白对照组相比,模型组海马区兴奋性氨基酸Glu的含量增加(P＜0.01)。穴位埋线组、针刺组及丙戊酸钠组与模型组比较大鼠海马内Glu的含量明显减少(P ＜0.01),且穴位埋线组及丙戊酸钠组Glu水平少于针刺组(P＜0.05),穴位埋线组及丙戊酸钠组间无明显差异(P＞0.05)。

由图4可知,模型组GABA含量较空白对照组少,且由图3可知Glu含量较空白对照组多,说明癫痫造模成功。模型组海马区GABA的含量低于空白对照组(P ＜0.01)。但穴位埋线组、针刺组及丙戊酸钠组GABA的含量均高于模型组(P＜0.01),穴位埋线组、丙戊酸钠组针刺组间GABA含量无明显差异(P＞0.05)。

2.3各组海马氨基酸GABA/Glu比值比较

由图5可知,模型组GABA/Glu比值低于空白对照组(P＜0.01),穴位埋线组、针刺组、丙戊酸钠组GABA/Glu比值高于空白对照组(P＜0.01),穴位埋线组、丙戊酸钠组及针刺组间GABA/Glu比值无明显差异(P＞0.05)。

图3　各组大鼠海马氨基酸Glu的比较(±s)

图4　各组大鼠海马氨基酸GABA的比较(±s)

图5　各组海马氨基酸GABA/Glu比值比较(±s)

3　讨论

相关报道表明,癫痫后神经元死亡,表现为神经元细胞凋亡,由此可知神经元细胞凋亡现象可间接反映癫痫的发作程度。本实验可知,穴位埋线可明显减低大鼠海马神经元细胞凋亡现象,说明穴位埋线可抑制大鼠癫痫的发生发展。而Glu为脑内兴奋性氨基酸,它存在于神经末梢胞质中,其兴奋性神经毒性作用可导致神经细胞变性和死亡[19],GABA为脑内抑制性氨基酸。Glu与GABA在脑内含量平衡关系影响着癫痫发生[20]。当脑内兴奋性与抑制性氨基酸之间平衡被打破,兴奋性因素增多,而抑制性因素减少,则导致癫痫发作[21]。穴位埋线能明显降低青霉素致痫大鼠海马神经元Glu含量,提高GABA含量,纠正癫痫大鼠海马Glu和GABA失衡的状态,调节兴奋性氨基酸递质和抑制性氨基酸递质的平衡,具有明显的抗痫作用。

本实验通过大鼠海马神经元凋亡情况及海马氨基酸的变化来表明大鼠癫痫的损害程度,可推测穴位埋线、针刺、西药都可在一定程度上减少大鼠癫痫情况的发生发展,表明穴位埋线、针刺、西药都可不同程度地减轻癫痫症状或减少癫痫发作对中枢神经系统的损害,在降低Glu的含量方面,穴位埋线较丙戊酸钠及针刺疗效显著,从而提高GABA/Glu比值,降低癫痫的发作。虽然重复穴位埋线与丙戊酸钠相比无明显优势,但穴位埋线为可被自体吸收的羊肠线,避免了各类西药的毒副反应,同时避免了反复针刺造成的疼痛,就癫痫而言,穴位埋线还克服了癫痫发作时不易针灸的弊端。

中医通过几千年对癫痫的认识与研究,积累了丰富的癫痫治疗手段与方法[22-24]。临床及实验研究表明,长强及百会为治疗癫痫要穴[25-30]。长强为督脉络穴,督脉统领一身阳气,故埋线于长强可醒神开窍,调节阴阳,配合督脉与足太阳交会之百会穴,可熄风宁神醒脑,使癫痫得以缓解。配合以针灸为基础的穴位埋线法,使得癫痫有了方便而行之有效的治疗方法。穴位埋线的整个操作过程集合了中医的针刺、刺血、留针、穴位封闭等多种刺激反应[31-33]。这些反应互相配合,共同发挥作用,形成一种持久柔和而复杂的非特异性刺激冲动,一部分通过传入神经到达相应神经节段的脊髓后角,抑制相邻的病理传导,抑制脏腑内作用,另一部分通过脊髓后角上传至大脑皮质,抑制病理刺激传入中枢系统,再通过神经-体液调节来调整脏腑,以治愈疾病[34]。

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Effectof Acupoint Catgut Embedding on Hippocampal Neuronal Apoptosisand Amino Acids in Epilepsy Rats

JIN Ze1,CAO Xiao-ting2,WANG Chun-ying1,WANG Yu-lin1,CHEN Jing1.1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital,Harbin 150001,China;2.Heilongjiang University ofTraditionalChinese Medicine,Harbin 150040,China

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.02.0218

1005-0957(2016)02-0218-05

黑龙江省自然科学基金项目;黑龙江省科技厅面上项目(D201286)

金泽(1965-),男,教授,博士后,Email:j inze3399@163.com

曹晓婷(1988-),女,住院医师,硕士,Emai l:qiaoyi1988hel ls@163.com

2015-05-20