灵芝酸对家兔免疫性肝损伤的研究

杨朝令,李仲娟,2,汪宏良,2*,丁　航,杨细凤,蔡小康

(1湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003；2黄石市中心医院，湖北 黄石 435000)



灵芝酸对家兔免疫性肝损伤的研究

杨朝令1,李仲娟1,2,汪宏良1,2*,丁航1,杨细凤1,蔡小康1

(1湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003；2黄石市中心医院，湖北 黄石 435000)

摘要：为研究灵芝酸对异烟肼所致免疫性肝损伤的保护作用，采用180 mg/kg异烟肼灌胃制备家兔免疫性肝损伤模型。罗氏全自动生化仪测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬酸氨基转移酶(AST)含量；HE染色法观测家兔肝脏病理学变化；ELISA法检测血液中干扰素(INF-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量变化；分光光度法测定肝组织中丙二醛(MDA)的含量。结果为：异烟肼20 h可诱导家兔免疫性肝损伤血清中ALT和 AST的含量分别为136 U/L和248 U/L；灵芝酸干预后ALT和 AST分别为67 U/L和126 U/L；HE染色法观察灵芝酸干预后肝脏尚存少量的空泡；INF-γ和TNF-α分别从26.41 pg/mL和21.86 pg/mL下降为22.67 pg/mL和18.82 pg/mL；MDA从3.54 μmol/L下降为1.5 μmol/L。灵芝酸对免疫性肝损伤的保护作用可能是通过下调细胞因子分泌、降低肝脏MDA水平、抑制脂质过氧化反应来完成。关键词：免疫性肝损伤；细胞因子；脂质过氧化反应

灵芝酸是赤芝的酸性提取物，已被报道的药理作用包括抗肿瘤、降低血脂、活化免疫细胞及对肝脏损伤的保护作用等[1]。近年来，由于分子药物机理研究水平的提高，肝脏免疫性损伤研究TNF-α和MDA得到广泛关注[2]。本研究通过180mg/kg异烟肼灌胃家兔，建立急性免疫性肝脏损伤模型[3-4]，通过灵芝酸对免疫性肝脏损伤模型动物的干预，对免疫性肝脏损伤模型动物肝脏病理学观察、肝细胞生化酶、细胞因子和氧自由基等指标的比对，揭示灵芝酸在免疫性肝损伤的病理过程中对肝脏的保护机理。

1材料

1.1动物

家兔在室温保持在25 ℃左右的动物室适应性饲养1周，将10只家兔设为空白对照组，40只家兔设为异烟肼建模组，建模成功后选择20只分异烟肼模型组和灵芝酸干预组，每组10只家兔。对照组灌胃蒸馏水，家兔建模按180 mg/kg灌胃异烟肼，分别采取0,4,8,12,16,20 h血液检查肝功能,其中灵芝酸干预组在灌胃异烟肼6 h后灌胃1 mL/kg灵芝酸溶液，每隔4 h一次，并按建模的时间点收集血液备用。

1.2试剂

灵芝酸提取物由黄石三九药业有限公司提供；灵芝酸悬液1 mg/mL，用生理盐水配置悬液；异烟肼(上海信谊药业)，使用前研磨成粉，用超纯水配置浓度为90 mg/mL乳白色悬液；MDA和双缩脲蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3仪器

超纯水机购自上海泰和公司；湖南湘仪实验室仪器开发有限公司高速冷冻离心机；苏净集团苏州安泰空气技术有限公司生物洁净安全柜；海尔冰箱；日本Olympus生物显微镜；罗氏全自动化生化分析仪。

2方法

2.110%肝组织匀浆的制备

取出新鲜家兔肝脏，用电子天平称取1 g肝组织，剪成细小碎块，取0.25 mol/L蔗糖-Tris-HCl(pH为7.4)9 mL入无菌培养皿中，用2片一组载玻片磨砂端对家兔肝脏碎块进一步研磨并使组织匀浆化。继以3 000～4 000 r/min离心10～15 min，轻轻吸取适量上清液进行各种测定。

2.2测定家兔血清生化指标

用罗氏全自动生化分析仪检测各组家兔血清AST和ALT值。

2.3病理组织学检查

取肝左叶相同部位肝组织，10%福尔马林固定，常规脱水石蜡包埋切片后HE染色，光镜下观察肝脏病理变化。肝细胞炎症活动度计分参考Knodell的计分标准[5]。

2.4家兔血清细胞因子的测定

INF-γ或TNF-a检测按试剂盒说明书进行，取包被抗单克隆抗体96孔酶标板, 加入100 μL血清或已知浓度的标准抗体, 37 ℃ 孵育1 h,洗3次，再加入100 μL酶标抗抗体,继续孵育1 h, 洗3次后加入等量底物液室温孵15 min 再加入终止液。450 nm测定光密度值, 绘制标准曲线,计算样本细胞因子水平。

2.5肝组织MDA含量的检测[6]

按照说明书步骤，将样品和各种试剂依次加入试管，在保鲜膜封闭管口后刺一小孔，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷却，3 500 r/min离心10 min，取上清，532 nm波长、1 cm光径、蒸馏水调零，比色法测各管吸光度值，根据计算公式求出各样本中的MDA含量,肝组织匀浆的蛋白含量测定采用双缩脲法。

2.6统计学处理

采用 Excel分析软件，用t检验对各组数据进行比较,P<0.05有统计学意义。

3结果

3.1异烟肼模型动物血清生化指标变化

模型家兔血清中AST和ALT酶水平的观察结果见图1。图1(a)和图1(b)显示家兔肝损伤时，血清中AST和ALT从8 h开始升高，12～20 h维持较高水平，家兔血清中各个时间点的AST水平均比ALT水平要高。图1(a)显示灵芝酸干预组在12 h时可促使AST有效地下降，并可持续至20 h；而图1(b)显示灵芝酸干预组ALT有效的下降从8 h开始持续至20 h。

图1模型家兔血清中AST和ALT酶水平的观察

3.2家兔病理学观察

各实验组家兔的肝脏病理学观察结果见图2。家兔肝脏解剖发现其肝脏大体体积缩小，各组家兔肝脏外观色泽鲜红、质软，无明显差异。光镜下正常对照组家兔肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐,见图2(a)；异烟肼组家兔肝细胞以空泡变性为主及灶性炎胞浸润多，见图2(b)；药物干预组家兔肝细胞以空泡变性为主，见图2(c)。与异烟肼组相比，肝脏细胞灶性炎胞浸润消失，呈现明显好转趋势。

图2　各实验组家兔的肝脏病理学观察

3.3血清细胞因子的检测

家兔血清中细胞因子的检测结果见图3。血清中IFN-γ测定发现，异烟肼组8 h为26.41 pg/mL，与0 h(对照组)相比有显著性差异(P<0.01)；灵芝酸干预组为22.67 pg/mL，与异烟肼组相比有显著性差异(P<0.05)；血清中TNF-a的测定显示，异烟肼组8 h为21.86 pg/mL，与0 h(对照组)相比有显著性差异(P<0.01)；灵芝酸干预组为18.82 pg/mL，与异烟肼组相比有显著性差异(P<0.05)。

图3家兔血清中细胞因子的检测(黑条为0 h，白条为8 h的样本检测结果)

3.4肝组织中MDA的检测

家兔肝组织中MDA的测定结果见图4。图4中的结果显示，异烟肼组的MDA为3.54 μmol/L，与对照组1.1 μmol/L有显著性差异(P<0.01)；灵芝酸干预组为1.5 μmol/L，与异烟肼组有显著性差异(P<0.01)。

图4　家兔肝组织中MDA的测定

4讨论

肝脏是机体最大的解毒器官，它不仅拥有数目最丰富的肝细胞，还有中性粒细胞、肝枯否细胞和巨噬细胞等细胞。肝脏的损伤会直接造成肝细胞缺氧或水肿导致肝细胞中AST和ALT等酶的释放。而免疫性肝损伤的表现是多方面的，它可能会通过免疫细胞的激活，产生细胞因子，如巨噬细胞产生IFN-γ，肝枯否细胞释放TNF-α[7]，从而造成相应靶细胞中自由基的堆积，过量自由基通过氧化反应来攻击细胞器生物膜并与膜中不饱和脂肪酸反应造成脂质过氧化,引起细胞中线粒体、DNA、RNA 等广泛损伤[8]。本次研究通过异烟肼组的模型动物和灵芝酸干预组的模型动物的生物化学指标分析、病理学对照观察、细胞因子的释放和MDA产生变化，探讨灵芝酸在免疫性肝损伤中可能存在的保护机理。

建模实验结果表明,异烟肼灌胃8 h后可引起家兔 AST和ALT酶的升高。病理观察发现，肝细胞水肿、变性，中性粒细胞、淋巴细胞或巨噬细胞向肝脏聚集呈炎性反应，这些病理变化特征与Bollardme 的模型研究结果一致[9]。本实验中灵芝酸的干预作用设定在建模6 h后，随后每4 h干预一次直至20 h，将灵芝酸持续干预后所有结果与模型动物结果进行比对。灵芝酸的干预研究证明，1 mg/kg浓度灵芝酸干预组能减轻异烟肼模型家兔肝血清ALT和AST酶向正常水平恢复,降低炎性细胞因子TNF-α的释放，减轻肝细胞变性及炎性细胞浸润, 降低肝细胞浆MDA含量。由于MDA含量是评价组织中氧自由基的水平和脂质过氧化强弱的指标。这些结果也提示，灵芝酸在免疫性肝脏损伤中能够改善肝功能障碍，降低肝脏自由基水平，抑制脂质过氧化作用，保护细胞生物膜的完整，保护肝脏细胞的正常机能。该研究结果为免疫性肝脏损伤机理提供了理论依据。

参 考 文 献

[1]王明宇,刘强,车庆明,等.灵芝三萜类化合物对3种小鼠肝损伤模型的影响[J].药学学报，2000,35(5):326-329.

[2]禄保平,杨晓娜,许家艳.异烟肼灌胃建立小鼠急性肝损伤模型的研究[J].中国医药生物技术，2007，2(4)：286-290.

[3]廖艳，彭双清，颜贤忠，等.异烟肼肝毒性的代谢组学特征研究[J].中国新药杂志，2007，16(4)：288-292．

[4]刘林，秦建军，史树堂,等.肝损伤动物模型制作的研究进展[J].医学研究与教育，2009,26(5):92-94.

[5]吴涛,柳涛,郑培永,等.清肝活血方及其拆方对酒精性肝病大鼠CD14、TLR4表达的影响[J].世界华人消化杂志， 2008，16(30):3372-3380.

[6]杜宇琼，赵晖，付修文,等.水红花子对小鼠免疫性肝损伤的影响[J].中西医结合肝病杂志2007，17(3)：154-155．

[7]姜辉，吴芙蓉，夏伦祝，等.奇士乐对免疫性肝损伤小鼠的保护作用[J].中国中医急症，2010,19(6):990-992.

[8]薛洪源，侯艳宁，刘会臣，等.利福平异烟肼合用致小鼠肝毒性增加的机理研究[J].解放军药学学报，2002，18(6)：330-333.

[9]Bollard ME,Keun HC，Beckonert O，et al.Comparative metabonomics of differential hydrazine toxicity in the rat and mouse[J].Toxicology & Applied Pharmacology,2005,204(2):135-151.

(责任编辑吴鸿霞)

收稿日期：2016-03-05

基金项目：湖北省科技项目(项目编号：2011Cdc116)；黄石市科技项目(黄科农〔2012〕1号)；教育部留学生启动资金支持(编号：46-2)。

作者简介：杨朝令,讲师,硕士。

*通讯作者:汪宏良,教授,硕士，研究方向：分子生物学。

doi:10.3969/j.issn.2095-4565.2016.03.012

中图分类号：R965.3

文献标识码：A

文章编号：2095-4565(2016)03-0057-04

Study on Protective Effect of Ganoderma Lucidum onImmunological Liver Injury in Rabbits

Yang Chaoling1,Li Zhongjuan1,2,Wang Hongliang1,2*,Ding Hang1,Yang Xifeng1,Cai Xiaokang1

(1School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003;2Huangshi Central Hospital,Huangshi Hubei 435000)

Abstract：Objective:to study the protective effect of Ganoderma lucidum on immunological liver injury by isoniazide.Methods:Immunological liver injury model of rabbits were induced by being given isoniazid 180 mg/kg by gavage.The ALT and the AST were assayed by Roche automatic biochemical analyzer.Histopathologic changes of the hepatic tissues were observed by the HE stained method in rabbit.The serum INF-γ and and TNF-α levels were determined by ELISA.The content of MDA in serum was measured by spectrophotometry.Results:The ALT level decreased from 136 U/L to 67 U/L and the AST level was from 248 U/L to 126 U/L by Ganoderma lucidum on 20 h.A small amount of vacuolar degeneration were observed on hepatic tissues after Ganoderma lucidum intervention.INF-γ level decreased from 26.41 pg/mL to 22.67 pg/mL,TNF-α level was from 21.86 pg/mL to 18.82 pg/mL.MDA form 3.54 μmol/L to 1.5 μmol/L.Conclusion:The protective effect of Ganoderma Lucidum on immunological liver can be probably completed by regulating cytokines secretion,reducing MDA level and by inhibiting lipid peroxidation reaction.Key words：immunological liver injury；cytokines；lipid peroxidation reaction