响应面法优化香菇多糖脱色工艺研究

赵孝先，高玲，杨文，黄建丽，赵凯，，*（.河北医科大学第四医院，河北石家庄0500；.河北凯盛医药科技有限公司，河北石家庄05005；.江西欧氏药业有限责任公司，江西新余8004）



响应面法优化香菇多糖脱色工艺研究

赵孝先1，高玲1，杨文2，黄建丽3，赵凯2，3，*
（1.河北医科大学第四医院，河北石家庄050011；2.河北凯盛医药科技有限公司，河北石家庄050035；3.江西欧氏药业有限责任公司，江西新余338004）

摘要：选择不同大孔吸附树脂对香菇多糖提取液脱色，发现DA201-CⅡ树脂具有较好的脱色率，且对多糖的吸附也较少；在单因素试验基础上，通过Box-Benhnken中心组合试验和响应面分析法，以香菇多糖提取液浓度、树脂用量和温度为自变量，脱色率为响应值，确定了利用DA201-CⅡ树脂对香菇多糖提取液脱色的最佳工艺条件：香菇多糖提取液浓度为1.9mg/mL，树脂用量为11g/100mL，温度为51℃，脱色率达到最高为80.04%，多糖保留率最高为93.45%。

关键词：香菇多糖；大孔吸附树脂；响应面法；脱色

香菇多糖（Lentinan，LNT）是从伞菌科真菌香菇（Lentinus edodes）的子实体中分离到的一种β-1，3-葡聚糖，具有广泛的药理活性，如免疫调节作用、抗肿瘤、抗衰老作用、提高免疫和刺激干扰素形成、对化学物质所致肝损伤具有保护作用以及作为LAK细胞活性向上调节剂（LURA）等，已成为当前研究的热点［1-5］。在香菇多糖的提取液中，色素、杂蛋白以及一些小分子物质是主要的杂质，色素的来源主要有3个方面：1）原料本身带有的；2）菌体代谢所产生的；3）发酵液中某些成分的相互反应。目前多香菇多糖的脱色工艺主要有活性炭吸附法［6-9］、双氧水氧化法［10-11］、树脂吸附法［12-14］等，但脱色效果均不是很理想。本试验探讨了大孔吸附树脂对香菇多糖提取液中色素的脱色研究，以便为采用树脂吸附法脱色进行工业化设计及生产提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与设备

D3520、X-5、S-8、AB-8树脂：购于南开大学化工厂；DA201-CⅡ树脂：购于江苏苏青水处理工程集团有限公司。TU-1800S紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；HHS-4S电子恒温不锈钢水浴锅：余姚市上通温控仪器厂；TGL-15B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；FA2004电子分析天平：上海精科天平公司。

香菇多糖提取液：自制［15-17］。

1.2方法

1.2.1多糖含量测定

采用校正的苯酚-硫酸法［18］，在490 nm波长下测定香菇多糖含量。多糖保留率按以下公式计算。

1.2.2色素测定

采用紫外分光光度计法测定420 nm波长处的吸光度［19］。脱色率按以下公式计算。

1.2.3树脂预处理

大孔树脂的预处理：工业级新树脂使用前必须进行预处理，以去除树脂中可能含有的未聚合的单体、致孔剂及分裂物等毒性物质［20］。

大孔吸附树脂的静态法预处理：

1）用95%乙醇在室温条件下浸泡24 h，其间每隔15 min搅拌1次，每次浸泡2 h后滤出乙醇，加入新乙醇，最后用去离子水洗净；

2）用4%盐酸溶液室温浸泡3 h，再用去离子水洗净；

3）用5%Na0H溶液室温浸泡3 h，再用去离子水洗净；

4）用去离子水室温浸泡24 h，使树脂充分溶胀备用。

1.2.4树脂筛选

准确称取预处理过的各种大孔吸附树脂20 g，分别置于250 mL磨口三口瓶中，加入多糖浓度为2× 10-3g/mL的溶液100 mL，恒温振荡，每1 h测定各树脂的脱色率、多糖保留率。

1.2.5单因素条件确定

准确配置一定浓度的多糖溶液100 mL于锥形瓶中，按照一定比例加入大孔树脂，调节至一定温度后振荡，每1 h测定各树脂的脱色率、多糖保留率。

1.2.6响应面试验

利用单因素试验结果，利用Design-Expert试验设计软件对香菇多糖大孔树脂脱色工艺进行优化，以香菇多糖初始浓度、脱色温度、树脂加入量设计三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验。Box-Behnken中心组合试验因素与水平见表1。

表1　 响应面试验因素水平Table 1　Factors，levels and cade of variables for response surface design

2　结果与讨论

2.1树脂筛选

在静态吸附条件下，利用D3520、S-8、X-5、AB-8、DA201-CⅡ树脂对香菇多糖提取液进行脱色研究，结果见图1。

图1　 脱色率及多糖保留率Fig.1　Decolorization rate and polysaccharide retention rate

由图1中可以发现，在6种树脂中，D3520、S-8、X-5 3种大孔吸附树脂的脱色效果相差不是很大，大孔吸附树脂AB-8、DA201-CⅡ的脱色效果药明显优于其余3种树脂，大孔吸附树脂X-5、DA201-CⅡ的多糖保留率要明显优于其余3种树脂，综合考虑脱色率和多糖保留率，试验选择DA201-CⅡ大孔吸附树脂进行脱色工艺优化。

2.2单因素试验结果

2.2.1脱色温度

以脱色率和多糖保留率为指标，考察了脱色温度对脱色效果和多糖损失的影响。分别选取了20、30、40、50℃和60℃5个脱色温度进行大孔树脂脱色试验，结果见图2。

由图2可以发现，脱色率随着温度升高而增加，当温度达到50℃时，脱色率达到最大值80.05%，当温度继续增加时，脱色率出现了下降趋势；而多糖保留率随着温度的增加而出现缓慢的下降。这是由于高温会抑制大孔吸附树脂的吸附能力，导致其对色素和多糖的吸附量的减少。综合考虑脱色率和多糖保留率。选取50℃作为中心水平。

2.2.2树脂加入量

以脱色率和多糖保留率为指标，考察了树脂加入量对脱色效果和多糖损失的影响。分别选取了2.5、5.0、10、20、40 g/100 mL 5个树脂加入量进行大孔树脂脱色试验，结果见图3。

图2　脱色温度对脱色率和多糖保留率的影响Fig.2　The effects of extraction temperature on decolorization rate and polysaccharide retention rate

图3　树脂加入量对脱色率和多糖保留率的影响Fig.3　The effects of addition resin on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由图3可以发现，随着树脂加入量的增加，脱色率也随之增大，而多糖保留率会随着树脂加入量的增加而呈现下降趋势。这是由于足够量的树脂，虽然可以充分吸附色素，但是对多糖的吸附也会增大。综合考虑脱色率和多糖保留率。选取10 g/mL作为中心水平。

2.2.3香菇多糖提取液浓度

以脱色率和多糖保留率为指标，考察了香菇多糖提取液浓度对脱色效果和多糖损失的影响。分别选取了0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL和8.0 mg/mL 5个香菇多糖提取液浓度进行大孔树脂脱色试验，结果见图4。

图4　香菇多糖提取液浓度对脱色率和多糖保留率的影响Fig.4　The effects of lention concentration on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由图4可以发现，随着香菇多糖提取液浓度的增加，脱色率也逐渐增大，当香菇多糖初始浓度达到2 mg/mL时，脱色率达到最大（79.16%），继续增加浓度时，脱色率无明显变化。多糖保留率则随着香菇多糖提取液浓度的增加呈现出缓慢的下降，基本保持在93%左右。综合考虑脱色率和多糖保留率。选取2 mg/mL香菇多糖提取液浓度作为中心水平。

2.3响应面试验结果及数据分析

从单因素试验结果可以发现，3个因素对脱色率的影响非常明显，对多糖保留率的影响不显著。因此，以脱色率为响应值Y，试验结果见表2。

表2　响应面分析试验结果Table 2　Test design and results of response surface analysis

对所得试验数据进行回归分析，得到回归方程：

Y=79.99+0.31A+0.59B-0.44C-0.20AB+0.035AC-0.72BC-2.94A2-2.89B2-3.94C2

对回归模型进行方差分析，结果见表3。

表3　回归模型方差分析Table 3　Variance analysis of regression model

续表3　 回归模型方差分析Continue table 3　Variance analysis of regression model

回归模型P＜0.0001，表明回归模型极显著；失拟项P=0.258 0，不显著，说明该模型成立。回归模型中一次项B、C、二次项BC、A2、B2、C2对Y值的影响显著。模型相关系数R2=0.992 0，说明拟合程度好，校正决定系数R2adj=0.981 7。由F值可知，各因素对多糖脱色率的影响大小顺序为B（树脂加入量）＞C（浓度）＞A（脱色温度）。

2.4响应面分析及最优脱色条件确定

根据回归方程做出相应面分析图及等高线，见图5～图7，Y为脱色率。

图5　响应面法（脱色温度、树脂用量）立体分析图和等高线图Fig.5　The graph of response surface methodology（decoloration temperature，addition resin）including 3D and corresponding contour map

图6　响应面法（脱色温度、香菇多糖提取液浓度）立体分析图和等高线图Fig.6　The graph of response surface methodology（decoloration temperature，lention concentration）including 3D and corresponding contour map

图7　响应面法（树脂用量、香菇多糖提取液浓度）立体分析图和等高线图Fig.7　Thegraphofresponsesurfacemethodology（additionresin，lentionconcentration）including3Dandcorrespondingcontourmap

回归模型中Y的最大估值为80.64%，与之对应的自变量脱色温度（A）、树脂加入量（B）和香菇多糖提取液浓度（C）分别为50.59℃、10.55 g/100 mL、1.94 mg/mL。根据实际操作，选取脱色温度（A）=51℃，树脂加入量（B）=11 g/100 mL，香菇多糖提取液浓度（C）=1.9 mg/mL。

2.5验证试验

在优化后的脱色条件下进行3次平行验证试验，结果表明DA201-CⅡ树脂对香菇多糖脱色率为80.04%，多糖保留率为93.45%，与预测者接近，及拟合度良好。

3　结论

采用了响应面分析法对香菇多糖提取液进行了大孔树脂脱色研究。通过树脂筛选得到了适合香菇多糖脱色的大孔树脂DA201-CⅡ；利用单因素试验与Box-Benhnken中心组合试验。对脱色工艺进行了因素考察优化。通过二次回归获得了各个因素的回归模型，并得到了最优脱色条件：脱色温度（A）=51℃，树脂加入量（B）=11 g/100 mL，香菇多糖提取液浓度（C）= 1.9mg/mL。其脱色率为80.04%，多糖保留率为93.45%，该结果为树脂吸附法脱色进行工业化设计及生产提供基础数据。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.024

作者简介：赵孝先（1968—），男（汉），主治医师，学士，从事药物研发与临床应用。

*通信作者：赵凯（1965—），男（汉），正高级工程师，博士，主要从事药物研究与开发工作。

收稿日期：2015-05-19

Optimizaition of Decolorization of Lentinan Using Response Surface Methodology

ZHAO Xiao-xian1，GAO Ling1，YANG Wen2，HUANG Jian-li3，ZHAO Kai2，3，*

（1.The Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，Hebei，China；2.Hebei Kingsci Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Shijiazhuang 050035，Hebei，China；3.Jiangxi Ourshi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Xinyu 338004，Jiangxi，China）

Abstract：The application of macroporous adsorption resin to purify lentinan，it was found that macroporous adsorption resin DA201-CⅡhad the highest decolorization rate and the lowest polysaccharide retention rate.With decolorization rate as the response value，the influence of amount of lention concentration，addition resin，and decoloration temperature on the process of decolorization were investigated systematically by using one-factor experitments and Box-Behnken design.The results showed that the optimum decolorizing conditions of lentinan by resin DA201-CⅡwere as follows：lention concentration 1.9 mg/mL，addition resin 11 g/100 mL，decoloration temperature 51℃.Under this condition，the decolorization rate and retention rate of polysaccharide were 80.04%and 93.45%.

Key words：lentinan；macroporous adsorption resin；response surface methodology；decolorization