尾巨桉3个无性系外植体诱导技术研究

石 前， 梁秀莉， 李飞宇， 邓冬丽， 李丽芳， 李 俏*

(1.广西壮族自治区国有东门林场，广西扶绥 532108；2. 中种国际种子有限公司，北京 100028)



尾巨桉3个无性系外植体诱导技术研究

石 前1， 梁秀莉1， 李飞宇2， 邓冬丽1， 李丽芳1， 李 俏1*

(1.广西壮族自治区国有东门林场，广西扶绥 532108；2. 中种国际种子有限公司，北京 100028)

摘要[目的]研究尾巨桉3个无性系的外植体诱导相关技术。[方法]筛选最佳采集季节、最优取材部位、最佳消毒时间和最优植物生长调节剂(6-BA)浓度，提高尾巨桉无性系外植体的萌芽率。[结果] 3个无性系最佳诱导季节为春秋两季；外植体诱导取材的最佳部位是半木质化的枝条；DH32-26、DH32-28外植体的最佳消毒时间为7 min、DH32-29外植体的最佳消毒时间为5 min；适宜外植体诱导的植物生长调节剂组合为6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L，此时诱导萌芽率高。[结论]要提高外植体诱导的成功率，需从采集季节、取材部位、消毒时间以及植物生长调节剂组合方面综合考虑，该研究为尾巨桉苗木快速繁殖提供了理论依据。

关键词尾巨桉；无性系；外植体诱导

尾巨桉是尾叶桉和巨桉的杂交种，具有较强的抗病、抗虫、抗风等能力，目前在造林中推广应用较多的无性系是尾巨桉系列的优良无性系品种。当前已应用于造林的尾巨桉优良无性系主要有DH32-29、DH32-28、DH32-26、DH32-27、DH32-13等。在生产中尾巨桉无性系组培苗需求量增长迅速，促进了组培育苗技术的快速发展和日趋完善。然而组培育苗技术各环节中最核心的外植体诱导技术存在污染率高、萌芽率低、繁殖倍数低和驯化时间较长等问题，极大地影响了工厂化组培育苗生产的速度和质量，也增加了育苗成本。笔者对尾巨桉3个优良无性系进行外植体诱导技术研究，探索桉树不同无性系在组培技术上的差异性，寻求最佳的技术途径，提高诱导成功率和缩短诱导时间，有利于提高无性系组培育苗速度以及降低生产成本，同时也能完善补充尾巨桉的快繁技术，为尾巨桉苗木快速繁殖提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验地概况试验地位于崇左市扶绥县广西国营东门林场林科所国家良种繁育中心苗圃，地理坐标为107°15′～108°00′E、22°17′～22°30′N，东西长80 km，南北宽20 km，属于南亚热带地区，季风气候明显，年日照时数1 634～1 719 h，年平均气温22 ℃，极端最高温40 ℃，极端最低温-4 ℃, 年霜降3.1 d，位于十万大山的雨影区，雨量偏少，年降雨量1 100～1 300 mm，相对湿度74%～83%。

1.2材料供试材料为东门林场优良无性系DH32-26、DH32-28、DH32-29。DH32-26、DH32-28取自东门林场雷卡分场13林班内，DH32-29取自华侨分场22林班内，试验时间为2010～2013年。

1.33个无性系无菌培养繁殖体系的建立

1.3.1外植体采集。在同一无性系的林分内按优树选择的标准测树高、胸径，排除边缘木和孤立木，选好优树伐倒，待伐桩上萌发出枝条，经不断对萌芽修剪和防虫防菌的药物处理，枝条达到半木质化时便可剪取伐桩上萌发的枝条，外植体采集选择在连续5 d左右晴朗的天气之后，不能在清晨取材，因为10：00之前露水未干，空气湿度大，病菌易滋生，污染率增大，10：00之后经过阳光中的紫外线照射，减少了环境中真菌、细菌数量，以及外植体表面的病菌。外植体采集前要根据需要做好诱导前的准备工作，在伐桩上选取半木质化的芽条，剪去叶片只留叶柄后，立即放入装有水的桶里，防止蒸腾作用对外植体的影响，将不同无性系分别做好标记并捆扎好，对伐桩上剩下的生长过旺的枝条要进行修剪，以便下一批枝条萌发和成长。

1.3.2外植体预处理。采集回外植体，用毛刷轻轻刷洗枝条表面，放入清水中冲洗30～60 min，再用饱和的洗衣粉溶液浸泡，不停振荡，洗去枝条表面的灰尘，再反复用清水冲洗2～3遍，干净后进入接种室进行下一步处理。在超净台上将枝条剪成2 cm左右带1～2个腋芽的茎段，并装入无菌瓶内，用75%乙醇浸泡约30 s，立即用无菌水冲洗3～5次，选用“二步消毒法”对枝条进行处理，先用1%氯化汞处理后，用无菌水冲洗3～5次，接着进行氯化汞第2次处理，再用无菌水冲洗3～5次；用干净的滤纸吸干水分，剪去枝条被褐化的部分，插入培养基中。

1.3.3外植体诱导培养条件。接种后先用深色的布遮盖，在全暗条件下培养15 d，待出芽后置散射光下培养30 d。

1.43个无性系外植体诱导的研究

1.4.13个无性系在不同季节外植体诱导的研究。于春(3～5月)、夏(6～8月)、秋(9～11月)、冬(12月～次年2月)4个季节，将经过消毒剂灭菌后的不同材料接种于诱导培养基中进行诱导，统计尾巨桉3个无性系诱导的萌芽率、褐化率、污染率。

1.4.23个无性系不同外植体部位诱导对比研究。选取3个无性系枝条的上段(幼嫩部分)、中段(半木质化部分)、下段(完全木质化部分)进行诱导，对比尾巨桉3个无性系诱导的萌芽率、褐化率、污染率。

1.4.3氯化汞不同消毒时间对3个无性系外植体诱导的影响。设置氯化汞不同消毒时间(3、5、7、10 min)，研究3个无性系枝条在不同消毒时间下外植体诱导变化，设3个重复，每重复10瓶，每瓶1支，共30枝，统计尾巨桉3个无性系诱导的萌芽率、褐化率、污染率。

1.4.4 6-BA不同浓度对3个无性系外植体萌芽率的影响。使用改良的MS培养基为基本培养基，NAA浓度为0.4 mg/L，分别添加3个浓度(1.3、1.0、0.7 mg/L)6-BA，设3个重复，每重复10瓶，每瓶1支，共30枝，对比尾巨桉3个无性系诱导的萌芽率。

2结果与分析

2.13个无性系在不同季节外植体诱导情况一般来说，采集外植体的时间比较关键，在不同季节诱导的结果不同。3～5月正是万物复苏、萌动的季节，伐桩上容易萌发出大量的枝条，15～20 d可取1次枝条，这时期的桉树枝条已蓄积了充足的内源激素，所含的营养物质也较丰富，枝条的抗病性最强，因此3～5月是最适合做外植体诱导的季节。6～8月是汛期和旱期并存，高湿和高温天气交替，是病虫活跃期，这时候采集枝条带菌量大，诱导难度高。9～11月进入秋高气爽的秋季，天气比较干燥，也是诱导的好季节，由于一般选择在6～8月砍树伐桩，伐桩上萌芽量还比较少。12月～次年2月天气寒冷，枝条萌动时间长，萌芽率不高。由表1可知，3个无性系在各季节的萌芽率和污染率稍有差异，但其表现是基本一致的，在春秋季诱导的萌芽率比较高，夏冬季诱导的萌芽率比较低。总体来说，DH32-29无性系在各季节诱导的萌芽率优于DH32-28和DH32-26。

表1　3个无性系在不同季节外植体诱导情况

2.23个无性系的不同部位外植体诱导情况外植体的生理年龄对诱导成功率有一定的影响，越靠近伐桩基部的枝条生理年龄越老，越远离伐桩基部的枝条生理年龄越小。由表2可知，虽然3个无性系的不同部位诱导的结果稍有差别，但在不同部位有共同的规律，即选取半木质化部位诱导效果是最好的，此部位萌芽枝数多，污染率较低，褐化率也较低；而上段的枝条太嫩，腋芽容易被消毒剂杀死，褐化严重，又因其远离树桩，接触到的微生物少，所以污染率比较低；下部枝条已完全木质化，腋芽不易萌发，萌芽率低，萌出的芽质量不好，枝条又靠近树桩，容易感染微生物，诱导率低，褐化率也高。由于3种无性系的遗传物质不同，其外植体诱导也稍有差别，DH32-29诱导可选取的枝条多，诱导的萌芽数较多，是一个比较容易诱导的无性系，DH32-26、DH32-28伐桩上的萌芽较少，诱导萌动率相对DH32-29较低，诱导比DH32-29难。

2.3氯化汞不同消毒时间对3个无性系外植体成活率的影响用于诱导的外植体所处的环境比较复杂，灰尘及许多微生物附着在其表面，使得外植体携带的菌落多，容易造成污染，所以外植体诱导时要对其进行表面灭菌处理，消毒时间的长短对诱导结果有不同的影响。

由表3可知，消毒时间对诱导的结果有影响，3 min的消毒时间较短，虽然枝条褐化轻，但枝条中的内生菌未被杀死，造成严重污染，影响了腋芽的萌发；5～7 min的消毒时间比较合适，此时污染轻，萌芽多；10 min的消毒时间太长，已杀死了腋芽芽点，使腋芽难以萌发。随着消毒时间的加长，各无性系接种枝条褐化越来越严重。综合分析可知，DH32-26和DH32-28外植体的最佳消毒时间是7 min，DH32-29外植体的最佳消毒时间是5 min。

表2　3个无性系的不同部位外植体诱导情况

表3　氯化汞不同消毒时间对3个无性系外植体成活率的影响

2.46-BA不同浓度对3个无性系外植体萌芽率的影响由表4可知，3个无性系在6-BA为1.0 mg/L时，诱导萌芽率最高，此时DH32-29外植体诱导萌芽率为80.0%、DH32-28为71.1%、DH32-26为68.9%。

表46-BA不同浓度对3个无性系外植体萌芽率的影响

Table 4Effects of different 6-BA concentrations on explant germination rate of three clones

无性系Clones6-BA浓度6-BAconcentration∥mg/L萌芽率Germinationrate∥%DH32-261.367.81.068.90.760.0DH32-281.370.01.071.10.762.2DH32-291.375.61.080.00.771.1

3结论与讨论

该研究结果表明，春秋两季是诱导尾巨桉外植体萌发的最佳取材季节，此时可供选择萌芽条多，污染率少，诱导成功率高。对茎段取材部位的研究表明，半木质化的枝条诱导效果是最好的。由于各无性系生理特性不同，采集的地理环境不同，带菌量也不同，用于外植体消毒的药剂种类也不同，该试验先用75%酒精处理外植体表面后，再用0.1%的氯化汞作为消毒剂，通过对4个不同时间的消毒处理进行研究，结果表明3个无性系中，DH32-29外植体用HgCl2消毒5 min可取得较高的萌芽率，DH32-26、DH32-28外植体用氯化汞消毒7 min可取得较高的萌芽率。采用3个浓度的6-BA处理各无性系外植体，结果表明适宜外植体诱导的植物生长调节剂组合为6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L，诱导萌芽率最高。

在尾巨桉3个无性系的继代培养中，培养材料由于继代繁殖时间长、次数多，染色体变异可能性会增大，再生繁殖能力下降，因此要及时更换材料。植物种类不同，继代次数对其影响也不同，植物能保持原有的再生能力代数也不同，如除虫菊在5代后出现生长不佳的现象[1]，百合多次继代繁殖出现变异现象[2]，黑木耳菌种随着继代次数的增加而逐渐退化[3]，桉树随着继代次数的增加，树高及地径生长呈下降趋势，抗病力减弱[4]。经检测，桉树在30代内DNA水平上未发生变异[5]，要根据桉树这一特点，及时重新诱导，获得新的植株，以保持繁殖材料的活力。

污染是尾巨桉无性系组织培养中一个难题，培养物受到污染，则不能正常生长，既浪费了材料和时间，又增加了成本，因此要提高外植体诱导的成功率，必须把控制污染放在第1位[6]。取材时要考虑是否在合适的季节和天气、植物材料的部位、选取消毒剂种类和浓度、消毒时间、接种操作过程等因素，从而减少外植体污染的可能性，取得诱导成功。

参考文献

[1] 齐静静，毛静，胡昊，等.继代次数对除虫菊生长及其除虫菊酯质量分数的影响[J].云南农业大学学报(自然科学版)，2014(2):216-222.

[2] 蒲秀琴，王舰，薛寒青.不同继代次数对东方百合组培苗分化的影响[J].青海农林科技，2008(1):55-56.

[3] 李晓，孟秀秀，李寿健，等.黑木耳母种继代培养次数与菌种退化关系研究[J].黑龙江农业科学,2015(4):138-139.

[4] 谭健明，蔡玲，王以红，等.不同无性繁殖复壮措施对桉树生长及抗病性比较研究[J].广西科学，2007(2):167-171.

[5] 覃子海，蓝肖，吴幼媚，等.利用ISSR检测桉树组培苗遗传稳定性的研究[J].热带农业科学，2013(4):26-29.

[6] 欧阳磊.桉树组培快繁中存在的问题与对策[J].福建林业科技，2006，33(1)：203-206.

作者简介石前(1982- )，女，湖南衡阳人，工程师，硕士，从事林木良种繁育研究。*通讯作者，从事桉树遗传改良和无性系开发工作。

收稿日期2016-04-03

中图分类号S 723.1

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)15-164-03

Study on Explant Induction of Different Hybrids ofEucalyptusurophylla×E.grandisClones

SHI Qian1, LIANG Xiu-li1, LI Fei-yu2, LI Qiao1*et al

(1. Guangxi Zhuang Autonomous Region Dongmen Forest Farm, Fusui, Guangxi 532108; 2. China Seed International Seed Co. Ltd., Beijing 100028)

Abstract[Objective] The aim was to study explant induction relevant technology of Eucalyptus urophylla × E. grandis three clones. [Method] The optimal collection season, sampling part, disinfection time and concentration of plant growth regulator(6-BA) was selected, so as to improve germination rate of explants of Eucalyptus urophylla × E. grandis clones. [Result] The spring and autumn were the optimal seasons for the explant induction, semi-lignified branches was the most suitable part of explant sampling, the most appropriate disinfection duration with mercuric chloride is 7 minutes for DH32-26 and DH32-28, and 5 minutes for DH32-29. 6-BA1.0 mg/L and NAA0.4 mg/L as plant growth regulator combination was good for explant induction which with the best germination rate. [Conclusion] In order to improve the successful rate of explant induction, a comprehensive consideration should be made in terms of the collection season, sampling part, disinfection time and plant growth regulator combination. The study can provide theoretical basis for rapid propagation of Eucalyptus urophylla × E. grandis seedlings.

Key wordsEucalyptus urophylla × E. grandis; Clone; Explant induction