SD大鼠睾丸中PELP1表达的激素相关性研究

祝　强，　董　隽，　王春扬，　单立松，　孙　帧，　朱大庆，　洪宝发

(中国人民解放军总医院泌尿外科,　北京　海淀区　100853)



基础研究

SD大鼠睾丸中PELP1表达的激素相关性研究

祝强，董隽，王春扬，单立松，孙帧，朱大庆，洪宝发

(中国人民解放军总医院泌尿外科,北京海淀区100853)

【摘要】目的：探讨PELP1在睾丸组织中的表达。方法：将21只8周龄SD大鼠随机分为对照组、去势组、去势并补充雌激素组。通过RT-PCR与免疫组织化学的方法进行检测，当雌激素水平不同时，PELP1在睾丸组织中的表达如下。结果：PELP1在大鼠睾丸组织中表达，并且随着雌激素水平的增高而增高。结论：PELP1在大鼠睾丸组织中的表达与雌激素水平正相关。

【关键词】雌激素;PELP1;SD去势大鼠;睾丸

雌激素具有生物调节作用，主要通过调节因子和雌激素受体作用于靶器官，如骨、脑、心及乳腺等。雌激素受体表达于睾丸间质细胞，与雌激素结合，调节睾丸间质细胞雄激素的合成与释放，影响生殖细胞的发生、发育。雄性动物体内的雌激素1/3来源于睾丸。虽然雄性动物血液中的内源性雌激素浓度较低，但是其在精液中的浓度却极高，睾丸网液中浓度达到250ng/L，与雌性动物血清中雌二醇相比，浓度明显偏高。PELP1具有重要调节作用，主要用于调节雌激素受体和雌激素，参与雌激素的非基因和基因两种信号的介导。在子宫、乳腺及脑等多种雌激素靶器官中均可发现PELP1表达，其表达与细胞生物学功能相一致，且具有明显差异性[1]。参与基因信号通路的PELP1主要于胞核中表达，PELP1与非基因通路相关，主要位于胞浆中。非基因通路与细胞的生长、凋亡、分化及增殖相关联[2]。作为雌激素作用的重要靶点，雌激素调节因子PELP1与睾丸组织存在必然联系。本文通过实验做进一步研究，证实睾丸组织中是否存在PELP1表达，其表达与雌激素水平是否相关，与年龄是否存在差异。

1材料与方法

1.1主要试剂:DMEM培养液(有康恒业生物科技(北京)有限公司)、枸橼酸盐抗原修复液(福州迈新)、cDNA合成第一链试剂盒(日本Toyobo公司)、胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司)、总RNA提取试剂(北京博迈斯科技发展有限术公司)、HRP标记的羊抗-兔二抗(美国SouthernBiotech公司)、兔抗-PELP1抗体(圣克鲁斯生物技术有限公司)、免疫组化试剂盒(上海佳和生物科技有限公司)、2×Trans Taq HIFI PCR SuperMixⅡ(北京全式金生物技术公司)。

1.2组织处理与实验动物:切除实验大鼠两侧睾丸，模拟雄性体内雌激素水平变化，建立动物模型。选取周龄为8的SD雄性大鼠24只，随机分为3组，每组8只，既为对照组(A组)、去势组(B组)，去势后补充雌激素组(C组)。麻醉大鼠，空腹注射3%戊巴比妥钠1.5mL/kg，对三组大鼠行开腹手术，仅摘除B、C两组大鼠的睾丸。对C组大鼠进行皮下注射17β-雌二醇20μg·kg-1·d-1，给予B组大鼠生理盐水作对照。术后对所有参与实验的大鼠行常规饲养16周后，实施麻醉，摘取新鲜睾丸组织，于4%多聚甲醛液中固定，制作5μm蜡块切片。所有参与实验的动物均来自正规实验动物管理中心。所有实验操作均遵守动物实验伦理原则和实验动物技术规范。

1.3睾丸组织细胞的分离与培养:消化法获得SD大鼠睾丸细胞。剪取新鲜SD大鼠睾丸组织，浸于含有0.1U/mL胶原酶和1U/mL胰酶的消化液中，孵箱37℃孵育45min。将消化后的组织接种于35mm含DMEM培养液的培养皿，37℃孵育过夜。培养24h后，更换新鲜培养液，去除悬浮组织与细胞。每3d换液一次，当细胞占瓶底≥80%时，取第3代细胞进行实验。将睾丸细胞分为不同雌激素浓度处理组、不同雌激素作用时间组，并以雌激素抑制剂ICI-182-780为对照，收集细胞，检测细胞中PELP1的表达。

1.4免疫组织化学:将睾丸组织切片PBS冲洗后，孵育于0.1%胰酶中，37℃孵箱孵育30min。将睾丸细胞以1×104个/cm2密度接种于盖玻片，细胞贴壁生长后，取出盖玻片，冷丙酮固定20min。免疫染色按照试剂盒说明书进行。切片或细胞3%双氧水冲洗10min，1% TritonX-100预处理10min，充分冲洗后，一抗孵育(兔抗鼠PELP1,1:1000)，放入湿盒，4℃过夜。取出细胞或切片，室温下复温20min，二抗37℃孵育20min(羊抗兔IgG)，PBS冲洗后，DAB染色。显微镜观察。

1.5实时定量PCR:使用总RNA提取试剂盒提取大鼠睾丸细胞RNA，实时定量PCR的方法检测睾丸细胞中PELP1的表达。行反转录反应，检验体系中加入即将得到的cDNA模板，使用实时定量仪行Real-time PCR反应，检测标准按照SYBR Premix Ex TaqTM II操作说明书。设计引物：β-actin：5’- CCTGGATAGCAACGTACATGG-3；5’- ACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’。PELP1：5’- TCACTGCCGAGAGACCCCCG-3’；5’- GGAAGATGGCGGCAGCCGTT-3’、

1.6Western-blot:胰酶消化法收集睾丸细胞，PBS冲洗后，置于RIPA裂解液中，冰上孵育10min，使细胞充分裂解，按照Beyotime细胞核蛋白抽提试剂盒说明，提取细胞全蛋白，并测定其浓度，所选用的试剂盒为Bradford试剂盒。在100℃的术中加入5×loading buffer，煮5min使变性。由于蛋白上样量为40μg，所以用1×loading buffer按照40～30 μL进行蛋白调整，保证其相同体积，行聚丙烯酰胺凝胶电泳。按预染的Marker切取所需目的条带，切割范围包含目的蛋白。转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，ECL显影，放入培清JS-860A自动凝胶成像仪曝光。

1.7PELP1阳性细胞计数:光学显微镜视野下，选取PELP1阳性表达的细胞，数码相机拍照，导入计算机，使用LUCIA G图像分析软件，计算阳性细胞表达数。保证每组数据测量3次。通过SPSS 12.0软件的使用对数据进行分析，采用“Tukey检验”进行多组间两两比较；采用“一维方差分析”进行两组间比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1检测血清雌激素水平:手术前和接受雌激素治疗18周后，OVX大鼠接受雌激素水平如下表。A组与C组之间无明显区别(P>0.05)；与A和C组相比，B组血清雌激素水平明显偏低(P<0.05)，(见表1)。

2.2PELP1在大鼠睾丸中的表达:阳性对照组为大鼠子宫(图1)，在大鼠睾丸组织中可见PELP1表达，PELP1为棕色颗粒，在胞核胞浆中可见均(图2)，胞浆表达最多(图3)。

图1

图2

图3

行免疫组化染色，记录每组组织切片阳性细胞数(平均阳性细胞率±标准差)。本文研究结果显示，雌激素水平不同时，PELP1阳性细胞率亦存在区别，差异具有统计学意义(P<0.05)；OVX组

2.3雌激素上调PELP1在大鼠睾丸细胞中的表达:与对照组相比，睾丸细胞中PELP1在雌激素刺激下的表达升高(Fig.3A3B)。在进一步的实验中发现，睾丸细胞中PELP1的表达随着雌激素作用浓度的提高而表达增加(Fig.3D)，随着雌激素作用时间的增加而表达增加(Fig.3C)，与雌激素的浓度、时间刺激呈正相关。

3讨论

内源性雌激素是雄性生殖细胞存活因子的一种，在雄性动物体内，内源性雌激素主要来自局部细胞的自分泌和旁分泌[3]。内源性雌激素主要存在于雄性动物的精液中，且浓度较高，在睾丸网液中达250ng/L，与雌性动物血清中雌二醇的浓度相比，明显偏高。睾丸内的雌激素主要由芳香化酶催化产生，而芳香化酶的基因突变会使男性睾丸小或隐睾、生精细胞缺如、无精子或精子密度显著降低、死精等症状。

研究表明，睾丸中雌激素受体高表达，雌激素与雌激素受体形成复合体，间接影响生殖器的发育和发生，直接参与睾丸间质细胞雄激素的释放与合成，调节睾丸的生殖功能[4]。雌激素受体具有调节作用，其调节途径主要有两种：非基因通路和基因通路，参与细胞的凋亡、增殖和生长，以及雌激素相关的组织保护功能相关。实验已证明雌激素受体基因敲除的小鼠，出生后睾丸正常，但青春期睾丸开始变性，成年后睾丸萎缩，精子发生障碍和精子密度显著降低并不育。

PELP1在雌激素靶器官中广泛存在与表达[5]。研究表明，细胞内PELP1的不同表达与定位，使PELP1发挥不同的雌激素受体调节作用。PELP1在在胞膜与胞浆中少量存在，在脑组织中与ER共表达胞核。在肌细胞和表皮细胞中，ER仅与PELP1共同定位于胞核，胞浆中无表达。本实验发现，PELP1主要表达于睾丸细胞胞浆中，提示PELP1的表达具有细胞特异性。本实验发现睾丸中PELP1蛋白与雌激素的相关性：①PELP1蛋白的表达与雌激素直接相关；②雌激素在基因与蛋白水平上调PELP1的表达；③PELP1的表达与雌激素的作用时间和浓度呈正相关，由此可知PELP1可能与睾丸细胞凋亡、增殖及生长有关，对睾丸组织可能具有保护作用。

【参考文献】

[1]李江源.精子发生的内分泌因素调节[J].生殖医学杂志,2014,23(9):697～702.

[2]傅冷西,李笃妙,张健星,等.隐睾症中激素和雌雄激素受体的研究[J].中华小儿外科杂志,2005,26(4):186～188.

[3]刘永杰,常青,白刚,等.无精子症患者FSH、LH与外周血和睾丸组织T、E2、T/E2相关性的研究[J].中国男科学杂志,2014,4(1):23～26.

[4]吴建云,王鲜忠,孙燕,等.雌激素β受体在大鼠睾丸中的表达与发育研究[J].实验研究,2010,2(9):6～8.

[5]Jonsson D, et al.The human periodontal ligament cell: a fibroblast-like cell acting as an immune cell[J].Periodontal Res, 2011,46(2):153～157.

【基金项目】中国人民解放军总医院苗圃基金面上项目，(编号：15MM39)

【文章编号】1006-6233(2016)06-0986-03

【文献标识码】A【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.06.040