中缅边境恶性疟原虫对青蒿素类药体外敏感性检测和K-13基因突变的相关性研究

张艳梅，吴艳瑞，胡　月，王丽琼，阮永华，马　宁，李思熳，王颖娜，贾丹丹，向　征，杨照青



中缅边境恶性疟原虫对青蒿素类药体外敏感性检测和K-13基因突变的相关性研究

张艳梅1,2,3，吴艳瑞4，胡月5，王丽琼1，阮永华5，马宁1，李思熳6，王颖娜1，贾丹丹1，向征1，杨照青1

1.昆明医科大学病原微生物系与免疫学系，昆明650500；2.昆明医科大学第一附属医院感染内科，昆明650500；3.云南公共卫生与疾病防控协同创新中心,昆明650031；4.昆明医科大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学系，昆明650500；5.昆明医科大学病理与病理生理学系，昆明650500；6.昆明医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系, 昆明650500

摘要：目的研究中缅边境恶性疟原虫对青蒿素类药物抗药机制。方法收集分离自2008—2010年中缅边境确诊为恶性疟病人体内的疟原虫，共34株，进行体外培养；提取原虫血DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)方法，扩增PF3D7-1343700(K-13)基因，对目标基因进行全基因测序，检测K-13基因变异情况；依据基因有无变异分为两组，对比两个组别疟原虫对3种抗疟药青蒿琥酯(Artesunate，AS)、双氢青蒿素(Dihydroartemisinine，DHA)和青蒿素(artemisinin，ART)的半效抑虫浓度(IC50值)，并与野生株3D7做对比；随后将这些疟原虫在环状体时期暴露于大剂量的DHA下，6 h后洗尽药物，再经过66 h培养后涂片，计算生存率(RSA)，比较变异株和非变异株之间有无差异。结果检测发现疟原虫K13基因存在137-142位点NN插入(占82.4%)，另有E252Q 、F446I、C469Y、R539T、P553L、P574L 、H719N位点突变，均伴有NN插入，其中F446I(占44.1%)。病人株的IC50值和野生株无统计学差异(P>0.05)，但病人株的RSA高于野生株(P<0.05)；有K13基因变异组和无变异组对AS、DHA、ART的IC50值无统计学差异(P>0.05)，但有基因变异组的RSA高于无基因变异组(P<0.05)。结论本研究结果发现K-13基因变异与恶性疟原虫对青蒿素类药物抗药性可能相关。

关键词：恶性疟原虫；青蒿素类药物；耐药机制;PF3D7_1343700

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos.U1202226,81161120421,31260508),the joint project from Science and Technology Department of Yunnan Province and Kunming Medical University(Nos.2015FB034,2014FB005), the Innovation Foundation of Kunming Medical University(No.2014-D2), the project of Yunnan Provincial Collaborative Innovation Center of Public Health and Disease Prevention and Control(No.2014YNPHXT05) and the National Natural Science Foundation of Yunnan Province(No.2012FB153)

疟疾是严重危害人类健康的寄生虫病，青蒿素类药物是我国自主研发的抗疟药，在疟疾的防治工作中取得了举世瞩目的成果。但随着青蒿素类药物的广泛应用，疟原虫对青蒿素类药物敏感性下降的报道不断出现[1-2]。到目前为止，恶性疟原虫对青蒿素类药物耐药的机理尚不明确，有研究报道提示恶性疟原虫对青蒿素的耐药可能和疟原虫的K-13基因变异有关。本次研究调查中缅边境恶性疟病人体内的疟原虫，进行体外药敏测定，并对这些疟原虫的K-13基因进行测序分析，了解K-13基因变异在中缅边境恶性疟原虫中多态性及与青蒿素类药物耐药的关系。

1材料与方法

1.1虫株来源本次试验所用虫株从2008—2010年中缅边境疟疾流行区确诊为恶性疟的病人体内分离(简称病人株)，共34株，病人在治疗前留外周血2～3 mL,冻存，备用。对照组为野生株3D7 ,来自Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4)。标本经过体外复苏培养成活，鉴定为单一感染株，进行试验研究。

1.2疟原虫培养疟原虫经复苏成活后参照改良的Trager-Jensen法[3]进行用完全培养液包含 HEPES(Gibco)、次黄嘌呤(Sigma)、Albumax II (Gibco)、RPMI 1640 (Gibco)、庆大霉素、NaHCO3(sigma)及O+RBC(来自云南省中心血站)培养，充入混合气体(3%O2，5%CO2，92%N2，购自昆明氧气厂)，拧紧瓶盖，放入37 ℃培养箱中培养，成活后保种，留取原虫血以备提取疟原虫的DNA。

1.3疟原虫DNA的提取及K-13基因的扩增。

1.3.1疟原虫DNA的提取将原虫血参照百泰克DNA提取试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)操作步骤提取原虫的DNA。-20 ℃保存备用。

1.3.2疟原虫K-13基因PCR扩增及测序K-13基因全基因测序，分为1片段、A片段及B片段3个片段，用PrimerPrimer5.0软件设计扩增引物，由上海生工生物公司合成。K-13基因扩增引物见表1。

表1　K-13基因3个片段引物

各个片段的反应条件均按以下操作：第一轮的反应体系为15 μL,即2XTag Master Mix 7.5 μL,引物(5 μmol/L)各0.5 μL,DNA 模板2 μL,去离子水4.5 μL。PCR反应条件：预变性95 ℃，5 min；变性95 ℃，30 s；退火56 ℃，30 s；延伸68 ℃，60 s；40个循环。最后延伸68 ℃，5 min。PCR产物4 ℃保存。

第二轮的反应体系为40 μL,即2XTag Master Mix 24 μL,引物(5 μmol/L)各1 μL,DNA 模板2 μL,去离子水24 μL。PCR反应条件：预变性95 ℃，5 min；变性95 ℃，30 s；退火56 ℃，30 s；延伸68 ℃，60 s；40个循环。最后延伸68 ℃；5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳。

1.3.3DNA测序及结果分析将PCR产物送生工公司进行测序用DNAStar软件分析测序数据。依据测序结果将标本分为有变异组和未变异组。

1.4测定恶性疟原虫对3种青蒿素类抗疟药体外IC50值3种青蒿素类抗疟药AS、DHA和ART(购自昆明制药集团有限公司)。待疟原虫密度达到1%以上时，进行青蒿琥酯(AS)、双氢青蒿素(DHA)、青蒿素(ART)3个药物的半效抑虫浓度IC50值的测定。将原虫密度稀释到0.5%，红细胞压积稀释到2%，加入配制好的药板中(药物为AS、DHA、ART,浓度为0.5、0.15、0.05、0.015、0.005、0.001 5、0.000 5、0.000 15 pmol/L)形成终浓度为：(100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03)nmol/L,依照WHO药板测定方法加入药板中，在5%的CO2培养箱中培养72 h后放到在-80 ℃冻30 min，然后移到37 ℃温箱中解冻，加入裂解液让细胞破裂，加SYBR Green I体外荧光法测量在药板中恶性疟原虫DNA含量的方法，测量恶性疟原虫在不同药物浓度下生长产生的DNA含量的光密度值，利用PRISM5.0 计算出半效抑制率(IC50)。

1.5恶性疟原虫在DHA压力下环状体时期生存率的测定恶性疟原虫在DHA压力下环状体时期的生存率(ring-stage survival assay即RSA)是一种新的体外测定恶性疟原虫对青蒿素类药物抗药性的检测方法。具体的方法为：待疟原虫的密度大于1% 时，将疟原虫密度稀释为1%，红细胞压积调整到2% 的，原虫血分为实验组及对照组各10 mL，加入培养瓶中。实验组加入200 nmol/L的DHA，对照组加入相同体积的0.1%二甲亚砜液(Sigma公司)。充入混合气(3%O2，5%CO2，92%N2，购自昆明氧气厂)，置于37 ℃二氧化碳培养箱中培养6 h后取出，充分洗去药物DHA，具体方法：抽吸上清液，将沉淀完全吸出，加入12 mL的1640液充分混匀后3 500 r/min离心5 min，去上清，再次加入1640液12 mL ,重复上述步骤1次，去上清后将沉淀转入新的培养瓶中加入新的完全培养液至总体积10 mL,充入混合气后放入培养箱培养66 h，然后取出培养瓶，去上清，沉淀涂薄片，用瑞-姬染色后两人分别显微镜镜检，计数玻片中20 000个红细胞中的环状体和滋养体的数量，如结果相差大于10%，重新镜检。生存率=实验组的环状体、滋养体总和与对照组的环和滋养体的总和比例再乘以100。

2结果

2.1K-13基因1、A、B片段二次扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳结果

2.1.1K-13基因1片段二次扩增产物1 000 bp左右目的片段结果见下图。

图1K-13基因1片段Nested-PCR二次扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳图

Fig.1Agarose gel electrophoresis for PCR amplification of part1 in K-13 gene

2.1.2K13基因A片段Nested-PCR产物电泳结果见下图，扩增860 bp左右目的片段结果。

图2　K13基因A片段Nested-PCR产物电泳结果图

Fig.2Agarose gel electrophoresis for PCR amplification of partA in K-13

2.1.3K-13基因 B片段 Nested-PCR产物电泳结果，扩增960 bp左右目的片段结果，见下图。

图3　K-13基因 B片段 Nested-PCR产物电泳图

Fig.3Agarose gel electrophoresis for PCR amplification of partB in K-13 gene

2.2病人株K-13基因变异结果本次实验检测了病人株的K-13基因，和野生株3D7的序列做对比，病人株K-13 基因有82.4%(28/34)存在137-142位点NN插入，6株(6/34占17.6%)无NN插入。另外有点突变：F446I(15/34占44.1%)、C469Y(1/34占2.9%)、 R539T (1/34占2.9%)、P553L(1/34占2.9% )、P574L(1/34占2.9% )、H719N( 1/34占2.9%)、E252Q(1/34占2.9%)均为单个的基因位点变异；有点突变株均有NN插入。

表2病人株对AS、DHA、ART的IC50值和RSA与野生株3D7对比表

Tab.2Comparision ofP.falciparumclinical isolates and standard strain(3D7) for drug susceptibilities in AS DHA ART and RSA exposed to high-dose of dihydroartemisinin

IsolateN(株)IC50值AS(C±Q)DHA(NM)ARTRSA(%)病人株clinicalisolates344.53±0.812.89±0.825.72±0.235.3野生株(3D7)Standardstrain14.20±0.912.19±0.284.6±0.41.0P值△0.020△0.010△0.001※0.001

注：△P>0.05，差异无统计学意义，※P<0.05，差异有统计学意义。

Note:△P>0.05，which is no significant difference in IC50s in P. falciparum clinical isolates and 3D7.※P<0.05，which is significant difference in RSA in two groups.

表3有变异组和无变异组对三种抗疟药的IC50值和RSA对比表

Tab.3Comparision of K13 gene mutations and no mutations for drug susceptibilities in three antimalaria drugs and RSA in 34 clinical isolates

IC50值N(C±Q)AS(NM)DHAARTRSAMean无变异组genemutations63.37±0.392.48±0.405.80±0.472.69变异组Nomutations283.54±0.152.90±0.145.77±0.167.73P值△0.67△0.28△0.94※0.01

注：△P>0.05，提示变异组和无变异组IC50 值无统计学差异，※P<0.05，提示两组间RSA值存在统计学差异。

Note:△P>0.05，which is no significant difference in IC50s of three antimalaria drugs in gene mutations and no mutations.※P<0.05，which is significant difference in RSA in two groups.

3讨论

青蒿素类药物是全球公认治疗疟疾的首选药，目前对疟疾的治疗仍有很好的疗效。但现全球已不断有青蒿素类药物疗效出现下降的报道，尤其在缅甸等东南亚国家，主要表现在疟原虫清除时间延长及复发[1-2]。青蒿素类药物的耐药问题不容忽视，目前疟原虫对青蒿素类药物耐药的机制尚不明确，有学者[4]提出疟原虫对青蒿素类药敏感性下降主要是原虫对药物产生了抗药性，他们观察到Pfmdr1基因变异在耐药株中表达高于非耐药株，耐药的疟原虫抗氧化防御系统更为完备，抗氧化的能力明显提高，足以对抗青蒿素类药物的作用。我们将来自中缅边境恶性疟病人体内的疟原虫进行AS、DHA及ART，IC50的测定，发现疟原虫的IC50值和野生株3D7对比，无统计学差异，体外试验提示来自病人体内的恶性疟原虫尚不需提高抗疟药的浓度来杀灭，这些原虫尚未出现真正的抗药性。

现在恶性疟原虫对青蒿素类药不敏感的机制主要集中在休眠学说[5]，K-13基因是近年来研究最多的与恶性疟原虫对青蒿素类药物耐药有关的基因，认为是由于该基因的变异，导致疟原虫休眠，即在红细胞内的环状体期延长，是原虫在不利于生长的条件下出现发育迟滞的现象。青蒿素类药物是短效药，恶性疟原虫通过休眠现象可躲过药物的作用，待药效高峰过后再继续发育，国外有很多研究提示疟原虫的休眠现象和K-13 基因基因变异有关,k-13基因变异与原虫在青蒿素类药物下生存率提高有关[6]。本次实验发现中缅边境的疟原虫在K-13基因有82.4%(28/34)存在137-142位点NN插入，另有点突变为E252Q 、F446I、C469Y、 R539T、P553L、 P574L、H719N，有基因点突变的虫株均有137-142位点NN插入，与Feng J等[7]报道的中缅边境恶性疟原虫K-13基因变异基本一致，变异主要集中在F446I；而有些报道[8-10]提示东南亚地区K-13 变异主要为C580Y变异。本次实验未发现A676D，N458Y，P441L等点突变[7，11]，有待于扩大样本量进一步研究。本试验发现有K-13基因变异组和无变异组的三种青蒿素类抗疟药的IC50值无明显差异，但 K-13基因变异组的RSA高于未变异组，表明K-13基因变异的疟原虫在DHA的压力下有更高的生存率，提示K-13基因的变异可能与疟原虫对青蒿素类药物的耐药有关。该研究同时提醒我们，RSA实验是理想的检测青蒿素类药物抗性的方法。

参考文献：

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.002

通讯作者：杨照青， Email:zhaoqingy92@hotmail.com

中图分类号：R382.3

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)03-0219-05

Corresponding author:Yang Zhao-qing ,Email: zhaoqingy92@hotmail.com

收稿日期：2015-10-08；修回日期:2016-01-15

In vitro susceptibility of Plasmodium falciparum to artemisinin drugs and K13-propeller polymorphisms at the China-Myanmar border

ZHANG Yan-mei1,2,3,WU Yan-rui4,HU Yue5,WANG Li-qiong1,RUAN Yong-hua5,MA Ning1,LI Si-man6,WANG Ying-na1,JIA Dan-dan1,XIANG Zheng1，YANG Zhao-qing1

(1.DepartmentofParasitology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;2.DepartmentofInfectiousDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China;3.YunnanProvincialCollaborativeInnovationCenterofPublicHealthandDiseasePreventionandControl,Kunming650031,China;4.TheDepartmentofcellBiologyandMedicalGenetics,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;5.TheDepartmentofPathologyandPathophsiology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;6.TheDepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China)

Abstract:This study aims to evaluate drug resistance mechanism to artemisinin derivatives in Plasmodium falciparum. The parasites of patients collected from the China-Myanmar border from 2008 to 2010 were cultured in vitro，and DNAs were extracted. The full-length of K13 gene was sequenced in all samples using polymerase chain reaction and direct sequencing methods. To measure drug susceptibilities in artesunate (AS), dihydroartemisinin (DHA) and artemisinin (ART) , we calculated the 50% inhibitory concentrations (IC50s). Parasites were exposed to high-dose of dihydroartemisinin in ring stage for 6 hours, and the survival rates of the ring stage (RSA) was calculated after 66 hours. We found that there were no difference in IC50s in patient isolates and Standard strain-3D7, and RSA in parasite isolates was significantly higher than 3D7. Sever point mutations(E252Q F446I C469Y R539T P553L P574L H719N)were identified in 58.8% of the parasite isolates, and F446I mutation predominated in 44.1% of the parasite isolates. NN-insert mutation predominated in 82.4%,the total point mutations were accompanied by NN-insert. All sample were divided into two groups:gene mutation and no-mutation.We found that there were no difference in IC50in gene mutation and no-mutation in K-13, and RSA in parasite isolates with K13 mutations was significantly higher than that in wild-type isolates. This result suggest that K13 mutations were possible correlated with artemisinin resistance.

Keywords:Plasmodium falciparum; artemisinin derivatives; drug resistance; PF3D7_1343700

国家自然科学基金(No.U1202226,81161120421,31260508)和云南省科技厅—昆明医科大学应用基础研究联合专项(No.2015FB034, 2014FB005),昆明医科大学创新基金(2014-D2)联合资助；云南公共卫生与疾病防控协同创新中心项目(No.2014YNPHXT05)；云南省自然科学基金(No.2012FB153)，张艳梅,吴艳瑞同等贡献