不同保存方法对“临床即用型”脂肪源性干细胞活性影响的评估

李朦 刘宏伟

[摘要]背景：脂肪源性干细胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）因其具备来源丰富、取材容易、具有多向分化潜能特点而成为现今成体干细胞研究的热点，同时其在临床研究及应用中也拥有广阔的前景。完善的提取设施及最符合临床使用规范的细胞使用及保存方法，是ADSCs能更安全有效的应用于临床的关键所在。目的：通过对现有的细胞保存介质、保存方法及保存时间进行综述，为临床即用型脂肪源性干细胞的短期运送及保存提供理论基础。方法：广泛查阅近年相关文献，对脂肪源性干细胞的研究历史、临床应用及其他成体干细胞的保存方式及临床转化应用进行综合论述。结果：4℃条件下保存细胞，对短期内细胞的活性和生物学特性影响最小，相对室温条件下有明显优势；血清是细胞培养中重要的成分之一，包含各种血浆蛋白、生长因子、碳水化合物等多种物质，能提供氨基酸、维生素、无机物等细胞生长必需物质，对脂肪源性干细胞的存活力及细胞增殖亦有促进作用；富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP）内含丰富的血小板，是全血中血小板数量3倍以上，能释放出多种生长因子，如血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）、表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）、类胰岛素生长因子（Insulin like growth factot，IGF）等，对脂肪源性干细胞的细胞增殖及分化功能有明显的促进作用。结论：4℃条件下使用含丰富的生长因子及无毒性的血清及PRP可能是较好的保存细胞活性及能安全使用的保存介质。

[关键词]脂肪源性干细胞；人血清；富血小板血浆；细胞保存

[中图分类号]Q813.1 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）04-0100-04

问充质干细胞是备受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞，其可在体外培养扩增，诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞及肌肉细胞等多种组织细胞，如骨髓源性问充质干细胞、脐带问充质干细胞等，但因其取材创伤大、纯化率低且数量有限，不能广泛用于实验研究及临床应用。2001年Zuk等从人脂肪组织中分离出了可以自我更新、具有多向的分化潜能的成纤维样细胞群，即脂肪源性干细胞（Adipose-derived stromal vascular fraction cells/stem cells，SVF/ADSCs）。ADSCs因其具有来源丰富、取材容易、增殖迅速、低免疫原性和免疫调节作用，不涉及道德伦理问题等优点，而受到广泛关注及研究。ADSCs作为成体干细胞家族的新成员，在再生医学领域展现了广阔的应用前景，并可能作为一种新的细胞产品或新技术用于临床研究及治疗。由于临床治疗的特点和需求，作为细胞产品从制备完成到治疗使用前的这一时间段（包括细胞产品的运输过程）如何保持细胞产品活力的最佳状态或进入人体后能发挥较好的治疗效果，保存方法是一个值得高度关注的问题。

ADSCs来自脂肪组织，可通过脂肪抽吸技术获取脂肪组织，使用胶原酶消化后离心可从抽吸的脂肪悬浊液中分离出血管基质碎片（stromal vascular fraction，SVF），ADSCs就包含于SVF中。有文献报道，在脂肪移植的早期，ADSCs的存在可以促进血管再生、增加毛细血管密度和血供；利用ADSCs进行自体脂肪移植即加入细胞辅助脂肪移植技术（cell-assisted lipotransfer，CAL）能显著提高脂肪移植的成活率并保有持续性，其存活率可达70%。通过研究发现，ADSCs不仅可以通过自我复制分化为脂肪细胞，还可以分化为血管内皮细胞或周围细胞，并且有研究指出在缺氧的环境下ADSCs可以分泌血管生长因子，通过表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰岛素样生长因子（insulinike growth factors，IGF）等来阻止脂肪细胞凋亡的发生，维持脂肪细胞的成活率。

1临床应用型细胞的长期保存

临床实践中干细胞的应用已有一定的发展，目前采用干细胞治疗的疾病有70多种，包括代谢性疾病、肿瘤、血液性疾病和免疫缺陷性疾病，如脐带问充质干细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC）、骨髓问充质干细胞、造血干细胞（Hematopoietic stem cell，HSC）等的应用。然而细胞的临床应用还存在着许多问题，特别是细胞的提取需要在严格的药品生产质量管理规范（Good Manufacturing Practice，GMP）实验室中进行，而现今很多医院不能满足细胞即提即用的条件，又或者细胞在提取后出现临时状况而不能及时的应用，所以如何保证细胞的最佳活力，妥善保存细胞显得尤为重要。

以往的研究中，许多学者已提出多种保存方法，主要的保存技术有：4℃非冷冻保存、程控降温液氮（-196℃）保存、-80℃直接冷冻保存。细胞冻存已经是国内外认可的一种相对成熟的细胞保存方法，2009年Baust JG等人将细胞的冷冻保存定义为：细胞、组织或者器官冷冻在-80℃尤其是-140℃以下能保证其存活能力的过程称为细胞的冷冻保存。有研究表明冻存1年的人脐带血管内皮细胞生物学特性无明显改变，也已有研究提出细胞在-196℃液氮环境下生化反应与活力代谢基本处于静止状态。Guangpengliu等人曾将人源性ADSCs储存于液氮中2周后复苏，证实冷冻保存对ADSCs的增殖能力及成骨分化能力无明显影响，是可以应用于骨组织工程中的一种细胞保存方式。在国内，也有低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响的研究，实验结果表明ADSCs冻存于液氮中1、3和6个月，复苏后仍具较高的存活率，并且其生物学特性保持稳定，仍具有多向分化潜能。在过去关于ADSCs的保存方法研究的报道相对较少，而对于其他干细胞的保存较多，例如Laure Calvet等人报道了109例-80℃简易冻存法冻存外周造血干细胞，粒系植入的中位时间是13d，血小板植入的中位时间是12d，细胞活性回收率极高。

虽然如此，细胞冻存还是存在很多问题，其中最主要的是细胞膜的不可逆性破坏，以至于细胞复活率低、复苏后的细胞活性差。导致这种结局的原因包括：①细胞毒性损伤；②在冻融的过程中冷冻保护剂的渗透性损伤：DMSO是目前最长采用的细胞冻存保护剂，但DMSO的临床应用还存在着很大的安全隐患；③细胞内冰晶形成的机械损伤；④解冻过程中细胞内再结晶的机械损伤。当降温速率过快，细胞内外同时形成冰晶，导致细胞损伤和死亡，如果复温速率过快慢，也同样如此。所以相对于临床要求来说，细胞冻存程序操作繁琐，且环境、设备要求高，不太适合临床即用细胞的应用。

2间充质干细胞短期保存的相关研究

现今大多数的研究主要聚焦于问充质干细胞的长期保存，对于细胞的短期保存和运输过程中的保存问题甚少有报道。Lane等提出满足临床应用要求的保存，复苏后细胞活性至少应达到80%。Daisuke Matsumoto MD.等人将抽吸后的脂肪分别存放于室温下1、2、4和24h，4℃下1、2、3d，及-80V下1个月，分别观察脂肪电镜下的形态变化及所含ADSCs的存活情况及活力的变化，结果显示，脂肪在室温下可以存放4h，在4℃下可以存放24h，所获得的ADSCs没有生物学改变。

时炳正等人比较了4℃条件下不同保存时间对小鼠骨髓间充质干细胞的细胞活性和生物学特性的影响，证实4℃条件下保存24h的小鼠骨髓间充质干细胞，活细胞的比例接近80%，细胞增殖和分化能力与0h相比无明显差异，是一种简洁有效的短期保存方法。陈京等人对临床治疗用人骨髓间充质干细胞保存条件进行研究，提出在4℃条件下，将间充质干细胞保存在5%人血清清蛋白氯化钠注射液中0.5h内回输对细胞活力影响最小。汪大琨等学者提出脐带间充质干细胞在长途运输时，选择16℃条件下加入1%白蛋白可以有效保证细胞存活量，但当运输时间大于8h时，细胞的存活率明显下降。也有学者提出不同意见，周楠等人认为无论4℃还是室温条件下，细胞在保存介质中的活性均在短期内呈时间依赖性下降，细胞死亡率呈时间依赖性增加。

3相关细胞保存介质的研究及选择

在细胞应用于人体之前，细胞质量与细胞的保存环境密切相关，这也直接关系到细胞移殖后的成效。除了温度和保存时间以外，细胞保存液的选择同样重要。在整形美容外科，ADSCs可单独或混合脂肪后移殖到人体需要的部位，什么样的细胞生存环境更有利于细胞的存活，使细胞具有更强的增殖分化能力呢？Yunsong Liu等人将ADSCs混合人富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）后的组织工程骨（ITB）注射到裸鼠的腹股沟区，通过观察细胞的增殖、分化能力来评估骨形成情况，结果表明，ADSCs与10%～12.5%的PRP混合后骨形成最佳。Sang Jin Cheon等人在研究ADSCs的培养条件时发现，VEGF对ADSCs的增殖有明显促进作用，其能够促进血管生成，其中又以成纤维细胞生长因子（FGF）最好，并且在实验中，学者有将培养细胞用的胎牛血清换为人血清，发现培养效果更好。

PRP含有超过生理浓度数倍的血小板，PRP激活后，血小板释放出大量的活性因子，这些生长因子和细胞因子可以通过激活细胞表面受体来调控基因的表达，介导细胞增殖、分化，以及参与细胞外基质的降解和组织重建过程。生长因子能刺激新生血管生成，增加受损组织的血供和营养，同时PRP获取过程创伤小、制备简便，其对组织再生、创面修复、细胞辅助运用有很重要的意义。刘景兰等人对兔ADSCs联合PRP对自体脂肪颗粒植入裸鼠皮下后血运重建进行研究，发现混入PRP后血管生成明显在增多，他们认为ADSCs与PRP联合可促进移植脂肪颗粒中血管生成。

干细胞体外扩增培养一般使用胎牛血清作为细胞营养的来源，但胎牛血清属于异源性物质，因其抗原性、致病性等原因不能应用于临床。有学者提出自体或异基因供者的血液成分，例如人血清、血浆、血小板等可作为替代性培养基补充物供临床使用。Su Jin Kim等人的研究中，证明了ADSC和BMSC在人血清中培养，可以保持干细胞的增殖和分化能力，是细胞和基因疗法应用于临床的理想选择。2011年，H Shafaei等人用人胎盘血清代替胎牛血清作作为ADSCs培养基的成分，证实人胎盘提供的细胞微环境比胎牛血清更佳。在Ana Cla、udiaChagas de Paula等人报道，在成骨培养媒介中加入同种异体的人血清，有利于体外细胞的体外扩增。由此可见，人血清和PRP对ADSCs的增殖及分化均有促进作用，同时取材容易，操作简单，成本低成效高，临床应用容易实现。

4小结

目前对于间充质干细胞保存，采用的保存方法主要为长期深低温冻存和短期4℃保存。长期低温冻存设备要求高、花费大，冷冻程序繁琐，需专人管理，难以推广，并且还存在着“针状冰晶胞内形成”、“冻存保护剂”对细胞的毒性及温度差致细胞凋亡的种种问题，所以并不适用于临床。4℃常规低温保存后细胞相对较安全，并且操作简单，容易实现，但长时保存同样存在着细胞的渗透性损伤问题，所以根据符合临床使用规范及设备条件，探讨保存温度、保存时间及保存介质对于ADSCs生物学特性的影响，选择适合的保存方法，才能使细胞治疗的临床应用得意实现。

综上所述，ADSCs在整形美容外科领域拥有很大的发展前景，并对修复组织或器官损伤、组织再生、容量流失及组织缺损的填充具有重要的临床意义。

编辑/张惠娟