牛布鲁氏菌四种血清学检测方法的比较

任 璐，周晓翠，范伟兴，武 瑞（.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 6334；.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 6603）



牛布鲁氏菌四种血清学检测方法的比较

任 璐1，周晓翠2，范伟兴2，武 瑞1
（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163314；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

摘 要：［目的］为在布鲁氏菌病临床检疫中选择可靠的血清学检测方法提供参考。［方法］对采集的294份牛血清样品用虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和补体结合试验（CFT）进行布鲁氏菌病抗体检测，比较RBT与ELISA，SAT与CFT的符合率及Kappa值，以CFT作为判定标准，比较四种检测方法的敏感性和特异性。［结果］ RBT与ELISA、SAT与CFT检测方法的符合率高达到95%以上，且Kappa值均大于0.75。以CFT作为判定标准，RBT和ELISA的敏感性较好，但有假阳性；SAT的特异性较好，但有假阴性。综合比较认为ELISA的敏感性和特异性都比较理想。［结论］临床工作中使用RBT或ELISA对布鲁氏菌病进行初筛，用CFT进行复核确诊，通过两种或两种以上的血清学检测方法联合诊断，结果较为理想。关键词：牛布鲁氏菌病；RBT；SAT；ELISA；CFT，比较

布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏杆菌引起的一种可威胁公共卫生和食品安全的严重人兽共患病，是国际贸易检疫中必检的一种传染病。布鲁氏菌可感染人类及多种家畜和野生动物，引起相似的临床症状与病理损伤，如发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等，严重危害人类健康和畜牧业生产［1］。选择可靠的布病诊断方法是防治布病的基础。目前用于布病诊断的常规技术有病原分离和血清学诊断。作为布病诊断“金标准”的病原分离技术存在采样困难、培养条件苛刻、易造成实验人员感染等缺点。因此，在现阶段的大规模检疫检测中，血清学仍是最常用的布病诊断技术。本文采用RBT、SAT、ELISA和CFT四种常规血清学技术对294份牛血清进行了布病检测，并对检测结果进行了对比分析，以便为当前布病血清学诊断提供参考。

1 材料与方法

1.1 血清样品

采自某地的未免疫牛血清样本294份，冷冻保存。

1.2 试剂

布鲁氏菌虎红平板凝集抗原、试管凝集抗原、补体结合抗原，布鲁氏菌ELISA试剂盒，购自法国IDEXX公司；补体、溶血素，购自郑州百基生物技术有限公司；标准阳性血清和标准阴性血清，购自中国兽药监察所。

1.3 主要仪器

酶标仪、超纯水纯化系统、电热恒温水浴锅、恒温培养箱、离心机、移液枪等。

1.4 试验方法

1.4.1 虎红平板凝集试验。参照动物布鲁氏菌病诊断技术（GB/T18646-2002）和法国的世界动物卫生组织（OIE）布病参考实验室培训要求进行操作与结果判定［2］：即试验前将抗原、待检血清样品及阴阳性对照平衡至室温（22±4）℃后，取25 μL待检血清，滴于洁净的玻璃板，然后取等体积虎红平板凝集抗原与血清充分混匀，室温作用4 min，判定结果。白色背景，自然光下观察，出现肉眼可见的凝集现象者判为阳性，完全不凝集者为阴性。每次检测只做8份血清样品，同时做阴阳性对照。

1.4.2 试管凝集试验和补体结合试验。参照法国OIE布病参考实验室培训要求进行操作与结果判定［2］。

1.4.3 酶联免疫吸附试验。严格按照ELISA试剂盒操作说明书进行操作与结果判定。

1.5 Kappa值的计算

Kappa值是医学上常用的一种用于测评计数资料一致性的方法，是评价一致性的测量值，是一致性的统计指标，能够反映出测量方法的相关程度。一般认为，Kappa值≥0.75，说明已经取得相当满意的一致程度，若Kappa值＜0.4，则说明一致程度不够理想［3］。

2 结果

2.1 四种血清学检测阳性率结果

用RBT、SAT、ELISA和CFT分别对294份牛血清样品进行布病抗体检测。根据《布氏杆菌病防治技术规范》要求，对RBT检测为阳性和可疑的血清样品，再进行SAT检测；结果为阴性的，则间隔30～45天对这部分牛进行重新采样检测，转阳性的则按照阳性统计，如果仍为阴性，则按照阴性统计。四种检测方法中SAT检测出的阳性样品最多，阳性检出率为31.29%；ELISA次之，阳性检出率为29.93%；SAT检测出的阳性样品数最少，阳性检出率为19.73%。四种检测方法检出的阳性数和阳性率结果见表1。

表1 四种检测方法的阳性数和阳性率

2.2 RBT与ELISA检测结果比较

用RBT和ELISA同时检测294份牛血清样品，通过RBT检测阳性数为92份、阴性为202份。对RBT检测为阳性的92样品通过ELISA检测，结果84份为阳性、8份为阴性；但RBT检测为阴性的，ELISA检测有4份为阳性，两种检测方法的符合率为95.97%，Kappa值为0.91。结果见表2。

表2 RBT与ELISA检测结果

2.3 SAT与CFT检测结果比较

对294份牛血清样品，通过SAT检测，结果阳性数为58份、阴性为236份。对SAT检测为阳性的58份样品通过CFT检测，结果全部为阳性；对SAT检测为阴性的236份样品，通过CFT检测，结果有阳性12份、阴性224份。两种检测方法的符合率为95.92%，Kappa值为0.88。结果见表3。

表3 SAT与CFT检测结果

2.4 四种检测方法相关性比较

在OIE参考手册中，CFT为牛布病国际贸易指定试验和血清学的确诊试验。本试验中以CFT检测结果作为判定标准，比较四种检测方法的相关性。70头CFT检测为阳性的牛，用RBT和ELISA也全部检出，二者的敏感性都为100%；用SAT检出58头，其敏感性为82.86%（58/70）。224头CFT检测阴性牛中，用RBT检出阴性202份，特异性为90.18%（202/224）；用SAT全部检出，特异性为100%；用ELISA检出206份，特异性为91.96%（206/224）。在本试验中，以CFT作为判定标准，RBT和ELISA都有一定的假阳性率，SAT有一定的假阴性率［3］。RBT的假阳性率为9.82% （22/224），ELISA的假阳性率为8.04%（18/224），SAT的假阴性率为17.14%（12/70）。结果见表4。

表4 四种检测方法相关性比较

3 讨论

本试验采用OIE布病参考实验室培训的RBT、SAT、ELISA和CFT血清学方法对492份牛血清样品进行检测，与我国现有国标《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18646-2002）相比，差异较大。SAT和CFT的血清稀释度不同，判定标准不同。通过对四种血清学检测方法的比较，发现无论是用于初筛的RBT和ELISA，还是用于复核试验的SAT和CFT，二者一致率都达到95%以上，Kappa值均大于0.75，说明已达到了相当满意的程度［4］。但与CFT检测结果相比，SAT、RBT和 ELISA都有一定的假阴性和假阳性。假阴性的存在，表明在检测过程有漏检的阳性畜，有引起疾病的蔓延的风险，不利于布病的净化；假阳性的存在，会造成对阴性畜的错判和误杀，从而造成不必要的经济损失。

目前布病血清学诊断方法种类较多，但还没有任何一种方法无论在敏感性、特异性还是在操作简便、易行、快速等方面都完美无缺。RBT操作简便并且用时短，敏感性高，但特异性低，只能作为初筛试验，环境和人为主观因素对结果影响较大；SAT检测的主要是IgM抗体，其容易受到动物体内其它交叉反应细菌产生的IgM抗体的干扰，导致其敏感性和特异性不高。在我国现行国标中，SAT仍作为确诊试验，但由于其敏感性和特异性较低，对牛布病的检测结果并不令人满意，OIE在国际贸易中己放弃使用该方法。但一些欧盟成员国一直要求，在国际贸易中用 SAT 检测个体动物，反应不得超过 30 IU［5］；ELISA是OIE标准中规定的国际贸易中布病检测指定试验方法，其具有高敏感性、高通量特点；CFT比SAT特异性强，也有标准化体系，但试验操作复杂，需有良好的实验设施和训练有素的人员做准确地滴定和试剂维护，这是世界公认的确诊方法。

在临床应用中，常需两种或两种以上的方法相互配合使用。要在国家或地区水平上控制布病，必须用快速而简单的试验进行普查，对检出的阳性反应样品要用更为特异的试验重检，予以确证。RBT 和ELISA都适用于布病普查。RBT检测成本较小，建议用于流行率较高、检测数量较大地区的布病初筛；ELISA的检测成本较高，但敏感性好于RBT，建议用于流行率较低、检测量较小地区的布病初步筛选；SAT是国标中法定的布病诊断方法，但此法过程较为繁琐，操作繁杂、费时，不适于现场应用和大批量样品的检测。

应强调的是，血清学检测方法虽然较多，但没有任何一种血清学试验适合于所有个体或群体的流行病学调查，特别是对个体进行筛查

时，所有的方法都有局限性，血清学检测方法的敏感性和特异性会因试验样本量的不同而有所不同［6-7］。本文采用的是以CFT 检测结果为阳性判定标准，因此在本试验中可能会存在假阳性的情况。

参考文献：

［1］ 王功民，池丽娟，马世春，等.我国畜间布鲁氏菌病流行特点及原因分析［J］.中国动物检疫，2010，27（7）： 62-63.

［2］ 张慧，张喜悦，范伟兴.法国布鲁氏菌病参考实验室的血清学检测方法［J］.中国动物检疫，2013，30（10）：34-37.

［3］ 齐景文，依颖新，周艳红，等.牛羊布鲁氏菌病四种血清学检测方法对比分析［J］.中国动物检疫，2015，32（4）：57-59.

［4］ 王蓓.临床流行病学［M］.南京：东南大学出版社，2004：25.

［5］ World Organization for Animal Health（OIE）.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animal［M］.Paris：OIE，2002：635.

［6］ Godfroid J，Saegerman C，Wellemans V，et al.How to substantiate eradication of bovine brucellosis when aspecifi c serological reactions occur in the course of brucellosis testing［J］.Vet.Microbiol，2002，90：461-477.

［7］ Nielsen K，Smith P，Yu W，et al.Serological discrimination by indirect enzyme immunoassay between the antibody response to Brucella sp.and Yersinia enterocolitica O∶9 in cattle and pigs［J］.Vet.Immunol.Immunopathol，2006，109：69-78.

（责任编辑：朱迪国）

Comparison of 4 Serological Tests for Bovine Brucellosis Detection

Ren Lu1，Zhou Xiaocui2，Fan Weixing2，Wu Rui1
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163314；2.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：In order to provide a reference for choosing an appropriate serological test method for bovine brucellosis in clinical detection，4 serological tests for bovine brucellosis detection were compared and analyzed.294 bovine serum samples were tested by Rose Bengal Plate Agglutination Test （RBT），Serum Agglutination Test（SAT），Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）and Complement Fixation Test（CFT），respectively.The coincidence rate and Kappa were compared between RBT and ELISA，SAT and CFT，respectively.The sensitivity and specifi city of the 4 tests were compared using CFT as a standard.The coincidence rate of RBT and ELISA，SAT and CFT was over 95% as well as the Kappa values ＞ 0.75.Taking CFT as a standard，the sensitivity of RBT and ELISA was better，but it exised a certain false positive.The specifi city of SAT was better，but it existed a certain false negative.ELISA had better sensitivity and specifi city than RBT and SAT.RBT and ELISA were suitable for screening，and CFT was suitable for defi nite diagnosing in clinical detection.It was better to choose more than two tests for diagnosis of bovine brucellosis.

Key words：bovine brucellosis；RBT；SAT；ELISA；comparison

中图分类号：S852.5

文献标识码：A

文章编号：1005-944X（2016）03-0074-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.03.025

通讯作者：武 瑞