银叶树果壳木质素提取及抗氧化性

庞庭才++熊拯++胡上英+廖燕青

摘要：采用碱液提取法对银叶树果壳木质素进行提取分离，以单因素试验和正交试验法研究提取温度、KOH浓度、料液比、提取时间对银叶树果壳木质素提取效果的影响，并对所提取木质素进行紫外光谱分析和抗氧化性研究。结果发现，银叶树果壳木质素最佳提取工艺参数为：提取温度60 ℃、KOH浓度0.5 mol/L、料液比1 g ∶ 55 mL、提取时间2 h，在此条件下木质素得率达到10.78%。银叶树果壳木质素浓度对羟基自由基、超氧阴离子自由基和对DPPH自由基均有明显的清除作用，且清除率随木质素浓度增加而增大。

关键词：银叶树果壳；木质素；抗氧化性

中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0385-04

收稿日期：2015-05-10

基金项目：广西高校科学技术研究（编号：2013YB260；2013LX161）；钦州学院校级科研项目（编号：2014XJKY-58C）；大学生创新创业训练计划（编号：201411607064）。

作者简介：庞庭才（1985—），男，硕士，实验师，研究方向为植物有效成分提取与分析。E-mail：pangtingcai@126.com。银叶树（Heritiera littoralis）属梧桐科植物，是热带、亚热带海岸红树林中的乔木树种，主要分布于我国广东、广西和台湾等地区，是比较典型的水陆两栖红树植物种类[1]。银叶树的根为板状根，茎高而大，叶背银白色，果实形状奇特，为近心形或近椭圆形或扁圆形，果皮木质化，外果皮坚硬[2]。有关银叶树的研究主要集中在地理分布与形态特征[3-4]、生物化学与遗传多样性[5-6]、抗性生理[7-8]、育苗造林技术[9-10]、资源利用[11-12]等方面，而对于银叶树果壳的研究还比较少。目前银叶树果壳常常在果实被采摘之后当作垃圾遗弃，这不仅造成资源的浪费，还对环境造成了一定的危害。因此，为了高效利用银叶树资源，有必要开展银叶树果壳木质素的研究。木质素是一种在酸作用下难以水解、具有复杂空间网状结构的聚芳基化合物，主要存在于木质化植物的细胞中，是工业上唯一能从可再生资源中获取的芳香族化合物[13]，具有较高地利用价值。但是由于木质素自身理化性质不均一、结构复杂、分离提取困难等因素，使得木质素至今没有被很好的利用。近年来，随着研究的深入，从花生壳、核桃壳、造纸废液中提取木质素的研究开始增多[14-16]，但从银叶树果壳中提取木质素的研究国内外尚未见报道。本研究采用一般碱法提取银叶树果壳中的木质素，并对所提取木质素进行紫外光谱分析和抗氧化性研究。通过对银叶树果壳木质素的研究，为提高银叶树的综合利用价值，进一步开发和利用红树资源提供一定的理论基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

银叶树果实外种壳，产自广西防城港北仑河口红树林保护区。

试验用氢氧化钾、盐酸、乙醇等试剂均为AR，1，1-二苯基-2苦肼基为BR。主要仪器有紫外可见分光光度计（UV-3200），上海美谱达仪器有限公司；电子天平（EL204）梅特勒-托利多（上海）有限公司；高速离心机（H1850），湖南湘仪实验仪器开发有限公司；旋转蒸发器（RE-3000），上海亚荣生化仪器厂；循环水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ）]，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2方法

1.2.1样品预处理银叶树果壳在60 ℃下干燥至恒质量，粉碎，过80目筛。用甲苯与乙醇混合溶液（体积比为2 ∶ 1）浸提10 h后过滤，回收甲苯-乙醇溶剂，滤渣40 ℃烘干至恒质量，得样品备用。

1.2.2银叶树果壳中木质素的提取称取预处理后的银叶树果壳粉末1.0 g，按一定的料液比加入一定浓度的KOH溶液，在设定的水浴温度条件下浸提一定时间，抽滤取滤液，用6 mol/L乙酸将滤液pH值调至5.5，减压蒸馏得样品浓缩液，加入浓缩液3倍体积的95%乙醇，混匀后静置，待沉淀完全后，抽滤。滤液通过减压蒸馏除去乙醇，用6 mol/L HCl 将样液pH值调至1.5，静置后过滤，所得滤渣用pH值为2的HCl溶液洗涤，低温干燥，即得到碱木质素[17]。

木质素得率=木质素产量原料质量×100%。

（1）

1.2.3单因素试验提取温度对木质素得率的影响在提取时间1.5 h、料液比1 g ∶ 55 mL、KOH浓度0.5 mol/L条件下，研究不同温度（40、50、60、70、80 ℃）对木质素得率的影响。

1.2.3.1KOH浓度对木质素得率影响在提取温度60 ℃、提取时间1.5 h、料液比 1 g ∶ 55 mL条件下，研究不同KOH溶液浓度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L）对木质素得率的影响。

1.2.3.2料液比对木质素得率的影响在提取温度60 ℃、提取时间1.5 h、KOH浓度0.5 mol/L条件下，研究不同料液比（1 ∶ 25、1 ∶ 35、1 ∶ 45、1 ∶ 55、1 ∶ 65，g/mL）对木质素得率的影响。

1.2.3.3提取时间对木质素提取得率的影响在提取温度60 ℃、料液比1 g ∶ 55 mL、KOH浓度0.5 mol/L条件下，研究不同提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）对木质素得率的影响。

1.2.4正交试验设计以银叶树果壳木质素得率为指标，在单因素试验的基础上进行L9（34）正交试验（表1），以确定最佳的银叶树果壳木质素提取工艺参数。

1.2.5紫外光谱的测定取一定量提取所得木质素样品，溶于适量乙醇溶液中，以乙醇溶液为空白，用紫外可见分光光度计测其在200～400 nm范围内的吸收光谱。

1.2.6木质素抗氧化性研究

1.2.6.1DPPH自由基的清除[18]称取0.003 8 g的DPPH用无水乙醇溶解，定容至50 mL，摇匀得到浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液，放于冰箱内备用。在具塞试管中分别加入 2 mL 浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的木质素样品溶液，再加入2 mL的DPPH溶液作为试验组，避光反应30 min后在波长517 nm处测定其吸光度。以2 mL样品溶液加入2 mL的无水乙醇作对照组，以2 mL的DPPH溶液加入2 mL蒸馏水中作为空白，计算对DPPH自由基的清除率。

清除率=D0-（Di-Di0）D0×100%。

式中：Di为试验组吸光度；Di0对照组吸光度；D0为空白吸光度；以无水乙醇作为参比。

1.2.6.2羟基自由基（·OH）的清除[19]称取0.083 4 g FeSO4·7H2O溶于少量蒸馏水中，定容至50 mL，得到 6 mmol/L FeSO4 溶液；称取0.041 4 g水杨酸溶于少量无水乙醇中，用无水乙醇准确定容至50 mL，得到6 mmol/L的水杨酸-乙醇体系；用微量移液器量取166.7 μL 30%的H2O2用蒸馏水定容至50 mL容量瓶中，得到0.1%的H2O2。在 15 mL 的具塞试管中分别加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，2 mL 6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，再分别加入2 mL浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL样品溶液，最后加入 2 mL H2O2启动反应，37 ℃水浴反应30 min后，以 4 000 r/min 速度离心 5 min，取上清液在510 nm处测定吸光度，以此作为试验组。以蒸馏水代替H2O2作为对照组，以蒸馏水代替样品作为空白。

清除率=D0-（Di-Di0）D0×100%。

式中：Di为样品组；Di0为对照组；D0为以蒸馏代替样品的空白。

1.2.6.3超氧阴离子自由基（ O-2 · ）的清除[20]在25 ℃的恒温水浴锅中，将pH值 8.2的Tris-HCl缓冲液和45 mmol/L邻苯三酚保温20 min后，取4.5 mL pH值8.2的Tris-HCl 缓冲液，加 0.3 mL 45 mmol/L邻苯三酚，振荡器混匀，在 25 ℃ 水浴中反应4 min，加入8 mol/L HCl终止反应，在 325 nm 测吸光度，计算出邻苯三酚的自氧化率V0。取 4.5 mL Tris-HCl缓冲液，加入不同浓度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL）的银叶树果壳木质素溶液2 mL在25 ℃恒温水浴中放置20 min后，加入 0.3 mL 的25 ℃预热的邻苯三酚溶液，振荡混匀，在25 ℃水浴中反应4 min，加入6 mol/L HCl终止反应，在 325 nm 测吸光度，计算出加入样品后邻苯三酚的自氧化率V1。

清除率=[（V0-V1）/V0]×100%。

式中：V0为对照组；V1为样品组。

2结果与讨论

2.1单因素试验结果

2.1.1提取温度对木质素得率的影响在40～60 ℃范围内，随着温度的升高，木质素的得率呈明显上升趋势，在 60 ℃ 时达到最大值；当温度继续升高时，得率反而有所下降（图1）。其原因可能是当温度较低时，由于纤维素上木质素结构结合紧密，结构破坏力大，使木质素分离不彻底，部分木质素还残留在果壳纤维中[21]，所以木质素的得率略低；当提取温度超过60 ℃时，会导致部分木质素分解，从而影响了木质素得率。因此，最佳提取温度为60 ℃。

2.1.2KOH浓度对木质素得率的影响随着碱液浓度的增大，木质素得率呈上升趋势，碱液浓度为0.5 mol/L时木质素

得率达到最大值，之后得率趋于平稳（图2）。结果表明，适宜的碱浓度可断裂木质素与糖聚物之间的酯键和醚键，而碱浓度较高时，木质素可能发生氧化和自身缩合反应造成损失。因此，最佳KOH浓度为0.5 mol/L。

2.1.3料液比对木质素得率的影响料液比在1 g ∶ （25～55） mL之间，木质素得率逐渐升高，料液比1 g ∶ 55 mL时得率达到最大值，之后随着料液比的继续增大，木质素得率反而有所降低（图3）。其原因可能是当料液比较小时，随着提取溶液的增加有利于木质素的溶出；但当料液比超过 1 g ∶ 55 mL 时，木质素得率趋于平稳，基本不再提高。因此，最佳料液比为 1 g ∶ 55 mL。

2.1.4提取时间对木质素得率的影响随着提取时间的增加，木质素得率呈上升趋势，当提取时间为2 h时，木质素得率达到最大值，之后随着提取时间继续增加，得率反而有所降低（图4）。其原因可能是在一定的时间范围内，随着提取时间的延长，木质素与纤维素分离程度逐渐提高，使得木质素得率也随之增大；而当提取时间达到2.0 h后，样品中木质素基本已经全部溶出，之后随着提取时间的继续延长，木质素得率也趋于平稳。因此，最佳提取时间为2.0 h。

2.2正交试验结果与方差分析

影响银叶树果壳木质素得率的因素主次为：KOH浓度

（B）>提取温度（A）>料液比（C）>提取时间（D）。提取木质素的最佳工艺参数为：A2B2C3D2，即提取温度为60 ℃、KOH浓度为0.5 mol/L、料液比为1 g ∶ 65 mL、提取时间为 2.0 h。在此条件下对最佳提取工艺进行验证试验，验证试验得到的木质素平均得率分别是10.68%、10.79%、10.80%、10.90%、10.74%（表2）。因此，银叶树果壳木质素得率为10.78%，说明该木质素提取工艺稳定可行。

2.3紫外吸收波谱分析

在200～400 nm范围内扫描，测得本试验所提取的木质素的紫外吸收光谱（图5）。在216 nm处产生最大吸收峰，这些是苯环物质典型的特征吸收峰，说明所提取得到的木质素为芳香族化合物。由紫外光谱分析表明，所提取的木质素含有苯环结构，具有较好的化学活性。

2.4抗氧化性研究结果

2.4.1对DPPH自由基的清除效果银叶树果壳木质素对 DPPH 自由基具有明显的清除作用，DPPH的清除率随着木质素浓度的提高而升高，当银叶树果壳木质素浓度达到 0.25 mg/mL 时，对DPPH自由基的清除率可达到80.6%（图6），说明银叶树果壳木质素具有较强的DPPH自由基清除能力。

2.4.2对羟基自由基（·OH）的清除效果银叶树果壳木质素对羟基自由基（·OH）具有明显的清除作用，羟基自由基（·OH）的清除率随着木质素浓度的提高而升高，当银叶树果壳木质素浓度为0.5 mg/mL时，对羟基自由基（·OH）的清除率为26.8%，当浓度达到2.5 mg/mL时，清除率可达到 83.7%（图7），说明银叶树果壳木质素具有较强的羟基自由基（·OH）清除能力。

2.4.3对超氧阴离子（ O-2 · ）的清除效果银叶树果壳木质素对超氧阴离子自由基（ O-2 · ）具有明显的清除作用，超氧阴离子自由基（ O-2 · ）的清除率随着木质素浓度的提高而升高，当银叶树果壳木质素浓度为0.1 mg/mL时，对超氧阴离子自由基（ O-2 · ）的清除率为45.1%，当浓度达到 0.9 mg/mL 时，清除率可达到89.8%（图8），说明银叶树果壳木质素具有较强的超氧阴离子自由基（ O-2 · ）清除能力。

3结论

（1）经正交试验分析，得到最佳提取工艺条件：提取温度为60 ℃、KOH浓度为0.5 mol/L、料液比1 g ∶ 65 mL、提取时间为2 h，在此条件下木质素得率达到10.78%。各因素对木质素得率的影响顺序为：KOH浓度>提取温度>料液比>提取时间。

（2）紫外光谱分析表明，在216 nm附近有较强的吸收带，所提取的木质素含有苯环结构，具有较好的化学活性。

（3）抗氧化性研究表明，对DPPH自由基、羟基自由基（·OH）、对超氧阴离子自由基（ O-2 · ）的清除率随着银叶树果壳木质素的浓度提高而提高，清除率最高分别为80.6%、83.7%、89.8%。

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