3种苯胺类对斑马鱼的急性毒性

裘丽萍++范立民+刘琦++陈家长

摘要：为研究N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺对斑马鱼的急性毒性，以斑马鱼（Brachydanio rerio）为试验生物，采用静态试验法，参照《水和废水监测分析方法（第四版）》中有关急性毒性的方法测定3种药物对斑马鱼的急性毒性LC50。结果表明，N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺对斑马鱼96 h的半数致死质量浓度LC50分别为66.08、146.15、76.82 mg/L，安全质量浓度分别为6.61、1461、7.68 mg/L。

关键词：苯胺类；急性毒性；斑马鱼；安全质量浓度

中图分类号： S941.91文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0325-03

收稿日期：2015-05-05

基金项目：国家水产品质量安全风险评估项目（编号：GJFP2014009）。

作者简介：裘丽萍（1977—），女，黑龙江双鸭山人，助理研究员，主要从事渔业环境保护研究。E-mail：qiulp@ffrc.cn。

通信作者：陈家长，硕士，研究员，硕士生导师，主要从事渔业生态环境监测与保护、养殖环境修复、健康养殖、生态环境评价等研究。E-mail：chenjz@ffrc.cn。鱼类是国际上常用于测试化学品毒性的物种。斑马鱼（Brachydanio rerio）别称花条鱼、蓝条鱼、斑马担尼鱼，原产于印度、孟加拉国，由于斑马鱼拥有其他模式生物所不具备的优点，已被广泛应用于生物学各领域[1-2]。

中国渔业产量连续多年居世界首位，但繁荣的同时却陷入“渔业资源严重衰退，生态债台高筑”的境地，渔业生态资本严重透支，渔业污染陷入难解的僵局。随着工业经济的快速发展，渔业污染事故的发生频率呈上升趋势，而工业废水污染是渔业水域最严重的污染源[3-6]。目前，渔业生产中使用的农药等对水生生物的毒性已引起广大科技工作者重视，并进行了很多重要研究[7-9]。然而，可能导致渔业污染事故的化工产品对水生生物的毒性却鲜有报道。N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺均是农药、医药、染料重要的中间体，采用这3种化工产品对斑马鱼进行急性毒性试验，判断其对鱼类的安全性，以期为苯胺类鱼类污染事故的预防提供数据支持。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

N，N-二甲基苯胺（含量>99%）、2，4二甲氧基苯胺（含量>98%）、2-甲氧基-6-甲基苯胺（含量>98%）、助溶剂二甲亚砜（含量>98%）均购自上海市安谱科学仪器有限公司，由德国CNW科技公司生产。移液枪（Eppendorf公司产品）、METTLER AL204型电子分析天平、5 L玻璃圆形水槽。

1.2试验材料

供试斑马鱼购自无锡市南禅寺花鸟鱼市场，平均质量为（0.20±0.02） g，平均体长为（2.4±0.2） cm。试验前对斑马鱼进行筛选，并在水族箱中驯养10 d以上，自然死亡率低于2%。驯养期间每天定时投颗粒饵料，试验前1 d开始禁食，选择活动性强的健康鱼作为试验用鱼，试验期间不喂食。试验用水为曝气3 d后除氯的自来水，pH值为7.02～7.06，总硬度为8.10～8.15（德国度），水质溶氧量含量保持在5 mg/L以上。水中Zn、Fe含量分别为0.02、0.05 mg/L，Pb、Cu、Cd均未检出。水质化学需氧量（COD）为2.05～2.25 mg/L，水温为（27±1）℃。

1.3试验设计

按照国家环境保护总局等编著的《水和废水监测分析方法（第四版）》[10]中有关急性毒性的方法进行测定。通过预备试验分别获得N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺致受试鱼100%存活的最高质量浓度、致受试鱼100%死亡的最低质量浓度，并在两者间选择下一步正式试验的浓度范围，确定5个试验质量浓度组。试验期间不喂食、不充氧。前8 h连续观察，记录鱼的反应情况并及时捞出死亡个体；分别于24、48、72、96 h观察鱼的死亡情况并记录。如果鱼的腹部向上，鳃盖停止运动，用玻璃棒或镊子反复轻击鱼的尾部均不产生任何应激反应，即判定死亡。

1.3.1N，N-二甲基苯胺对斑马鱼的急性毒性向盛有3 L曝气自来水的圆形玻璃水槽中加入N，N-二甲基苯胺储备液，使水中N，N-二甲基苯胺的质量浓度分别为50、60、65、70、80 mg/L。将水体搅拌均匀，放入10尾健康的受试斑马鱼，进行96 h的观察记录。每个质量浓度设3个平行组，并设空白对照组、助溶剂对照组。

1.3.22，4-二甲氧基苯胺对斑马鱼的急性毒性向盛有 3 L 曝气自来水的圆形玻璃水槽中加入2，4-二甲氧基苯胺储备液，使水中2，4-二甲氧基苯胺的质量浓度分别为120、140、165、170、185 mg/L。将水体搅拌均匀，放入10尾健康的受试斑马鱼，进行96 h的观察记录。每个质量浓度设3个平行组，并设空白对照组、助溶剂对照组。

1.3.32-甲氧基-6-甲基苯胺对斑马鱼的急性毒性向盛有3 L曝气自来水的圆形玻璃水槽中加入2-甲氧基-6-甲基苯胺储备液，使水中2-甲氧基-6-甲基苯胺的质量浓度分别为60、70、80、85、90 mg/L。将水体搅拌均匀，放入10尾健康的受试斑马鱼，进行96 h的观察记录。每个质量浓度设3个平行组，并设空白对照组、助溶剂对照组。

1.4结果分析

根据各组试验鱼在24、48、72、96 h的死亡数计算平均死亡率，再转化为概率单位，计算出试验液质量浓度的对数。采用直线回归法求出概率单位数与试验液质量浓度对数的回归方程，根据方程分别求出N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺在24、48、72、96 h对鱼类的半致死质量浓度LC50和安全质量浓度[10]。

2结果与分析

2.1N，N-二甲基苯胺对斑马鱼的急性毒性试验结果

在N，N-二甲基苯胺对斑马鱼的96 h急性毒性试验期间，空白对照组、助溶剂对照组的受试斑马鱼全部存活，活动正常；50 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验35 h后开始死亡，96 h死亡率为20%；60 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验 30 h 后开始死亡，48 h死亡率为20%，96 h死亡率为30%；65 mg/L 质量浓度组的受试鱼在试验18 h后开始死亡，96 h死亡率为40%；70 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验10 h后开始死亡，96 h死亡率为60%；80 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验3 h后开始死亡，96 h死亡率为80%（表1）。由表1还可知，N，N-二甲基苯胺对斑马鱼24、48、72、96 h的半数致死质量浓度LC50分别为83.90、77.50、73.10、66.08 mg/L，安全质量浓度为6.61 mg/L。

2.22，4-二甲氧基苯胺对斑马鱼的急性毒性试验结果

在2，4-二甲氧基苯胺对斑马鱼的96 h急性毒性试验期间，空白对照组、助溶剂对照组的受试斑马鱼全部存活，活动正常；120 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验40 h后开始死亡，96 h死亡率为20%；140 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验30 h后开始死亡，48 h死亡率为20%，96 h死亡率为30%；165 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验20 h后开始死亡，96 h死亡率为60%；170 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验8 h后开始死亡，96 h死亡率为90%；185 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验2 h后开始死亡，96 h死亡率为100%（表2）。由表2还可知，2，4-二甲氧基苯胺对斑马鱼24、48、72、96 h的半数致死质量浓度LC50分别为161.70、165.04、15865、146.15 mg/L，安全质量浓度为14.61 mg/L。

2.32-甲氧基-6-甲基苯胺对斑马鱼的急性毒性试验结果

在2-甲氧基-6-甲基苯胺对斑马鱼的96 h急性毒性试验期间，空白对照组、助溶剂对照组的受试斑马鱼全部存活，活动正常；60 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验80 h后开始死亡，96 h死亡率为10%；70 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验40 h后开始死亡，48 h死亡率为10%，96 h死亡率为20%；80 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验20 h后开始死亡，96 h死亡率为40%；85 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验 13 h 后开始死亡，96 h死亡率为80%；90 mg/L质量浓度组的受试鱼在试验7 h后开始死亡，96 h死亡率为90%（表3）。由表3还可知，2-甲氧基-6-甲基苯胺对斑马鱼24、48、72、96 h的半数致死质量浓度LC50分别为91.77、88.96、8420、76.82 mg/L，安全质量浓度为7.68 mg/L。

随着时间的延长，各质量浓度组受试鱼的死亡率均呈增加趋势；在同一时间下，高质量浓度组受试鱼的死亡率明显高于低质量浓度组。可见，受试药物对斑马鱼的毒性作用随药物暴露时间的延长及暴露质量浓度的增大而增强。

3讨论

3.13种苯胺类药物对斑马鱼的急性毒性级别判定

本研究使用的3种苯胺类药物的24～96 h半致死质量浓度依次降低，表明3种苯胺类药物对鱼的毒性均随药物暴露时间的延长而增强。以96 h半致死质量浓度为评判对象，由鱼类急性毒性分级标准[10]可知，N，N-二甲基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺均属于中毒物质，2，4-二甲氧基苯胺属于低毒物质。

3.23种苯胺类药物对斑马鱼的毒性评价

由表4可知，在96 h试验期间，N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺对斑马鱼表现出的毒性症状及毒性规律相似，96 h的LC50与安全质量浓度接近。可见，苯胺类化合物在苯环或氨基上引入甲基或甲氧基对其毒性影响不大，处理这类物质的渔业污染事故时可参考相似结构的化合物。

硝基苯等国内常用化工产品均会对受试鱼类产生遗传毒性[11]及对抗氧化应激酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等）[12]造成影响，甚至具有强烈的致癌、致畸、致突变作用[13]。N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺是农药、医药、染料重要的中间体，在农药、医药、燃料的使用和生产过程中进入水体，可能残留于水体中的鱼类体内，进而危害机体。N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺长期暴露对鱼类是否产生毒害，及其分子生物学机制有待进一步研究。

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