王草茎点霉叶斑病病原鉴定及生物学特性

张驰成++吴伟怀++粱艳琼++郑金龙++习金根++郑肖兰++唐文++许沛冬++李锐++贺春萍++易克贤

摘要：针对在广西横县发生的一种王草叶斑病害，为明确其病原种类，采用形态学和分子生物学方法进行了鉴定，并研究其生物学特性。结合致病菌的形态特征以及ITS序列系统聚类分析结果，将其鉴定为草茎点霉（Phoma herbarum）。生物学特性研究表明：该菌菌丝体适宜生长的温度为20～32 ℃，最适温度为25～28 ℃；菌丝体生长的最适pH值为5～8；菌丝体生长的最佳碳源为葡萄糖、蔗糖和甘露醇；最佳氮源为蛋白胨，而尿素则不适合菌丝体生长；光/暗交替或暗/光交替均有利于菌丝体生长；菌丝体致死温度为50 ℃，10 min。

关键词：王草；茎点霉；病原鉴定；ITS；生物学特性

中图分类号： S435.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0210-05

收稿日期：2015-02-06

资助项目：公益性行业（农业）科研专项 （编号：201303057）。

作者简介：张驰成（1992—），男，安徽马鞍山人，硕士研究生，主要从事热带牧草病害调查及病原鉴定等研究。E-mail：cczhang1992@126.com。

通信作者：贺春萍，硕士，副研究员，从事橡胶树根病的拮抗菌筛选等研究，E-mail：hechunppp@163.com；易克贤，博士，研究员，从事热带牧草、剑麻和芦笋真菌病害与抗性遗传育种研究，E-mail：yikexian@126.com。王草（Pennisetum）别称皇草、皇竹草，是以象草为母本、美洲狼尾草为父本杂交（Pennisetum purpureum×P.americanum）育种而成[1]。我国于1982年由中国热带农业科学院从哥伦比亚引进，经过多年试种选育而成，后定名为热研4号王草（Pennisetum purpureum×P.americanum cv. Reyan No.4）[2]。王草为多年生牧草，具有产量高、生长快、抗倒伏、耐干旱、抗病力强等特点，而且茎叶柔软口感好，营养丰富，以优质、高产而著称，被誉为“草中之王”[3]，是各种草食性牲畜和鱼类的优质饲料。适宜在我国热带及亚热带种植，目前已经在海南、广东、广西、云南等地成功种植，是华南地区最适于集约化栽培的刈割型禾本科牧草[4]。然而，随着种植面积的不断扩大以及种植年限的延长，各种病害逐渐发生并逐年加重，很大程度上限制了包括王草在内的牧草产量及质量[5-6]。牧草病害可使牧草生长量减少，产草量降低，营养成分含量和可消化率下降，有害物质含量增加，进而导致动物日增体质量减少[7]。王草作为南方主要热带牧草之一，同样面临多种病害尤其是真菌病害的影响。

2015年5月，在广西横县出现了成片王草大规模发生叶斑病的情况，且有迅速蔓延之势。为明确其病原，本试验通过病原菌形态学检查，结合分子生物学手段对该致病菌进行了鉴定，进而对其进行了生物学特性研究，以期为当地王草叶斑病害的发生及综合防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1 供试菌株从广西横县热研4号王草上采集病样，经室内无菌条件下分离及单孢分离纯化得到供试菌株。

1.1.2供试培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖15～20 g，琼脂15～20 g，ddH2O定容至 1 000 mL，自然pH值；查氏琼脂培养基（Czapek）：硝酸钠2 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂15～20 g，无菌水定容至1 000 mL。上述培养基均于121 ℃高压灭菌20 min后备用。

1.1.3试剂及仪器真菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′）由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。Taq酶、PCR buffer、dNTPs、DNA片段回收试剂盒及T1载体等均购自北京全式金生物试剂公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1病样采集及病原菌分离纯化采用常规组织分离法进行病原菌的分离纯化[8]。将田间采回的发病王草叶片冲洗干净、晾干，在病健交界处剪取（2～3） mm×（2～3） mm的组织块。于超净工作台中，首先用0.1% Hgcl2溶液消毒约 1 min，然后用75%乙醇漂洗30 s，经无菌水漂洗2～3次后用灭菌滤纸吸干，置于PDA培养基中，在25 ℃条件下培养2～3 d。待菌落长出后，从其边缘挑取菌丝块，置于平板PDA培养基上进行纯化，获得分离菌株。

1.2.2病原菌形态学鉴定将分离纯化得到的病原菌接种于PDA培养基平板上，25 ℃培养6～7 d，期间观察并记录菌落在培养基上的生长状况；在显微镜下观察菌丝体与分生孢子的形态，测量分生孢子的大小，并拍照保存。

1.2.3病原菌致病性测定取健康王草嫩叶，先用无菌水洗干净，再经75%乙醇消毒，并再次用无菌水冲洗后晾干。将直径5 mm的菌饼接种于经消毒针头刺伤的叶片（菌丝面紧贴在叶片伤口处），每叶接种2块菌饼，重复处理3个叶片，接种无菌培养基块作为对照。于托盘内保湿。接种2 d后开始观察发病症状，3 d后除去菌丝块，记录病斑大小和颜色。待接种叶片发病后，按照柯赫氏法则，从病部再分离病原菌，观察所得分离物与原接种病原菌的形态特征是否一致。

1.2.4病原菌分子生物学鉴定

1.2.4.1病原菌基因组DNA的提取和 PCR 扩增用真菌DNA提取试剂盒（Biomiga Fungal gDNA Kit）提取供试菌株DNA，于超微量紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度，其余的DNA溶液置于-20 ℃冰箱保存备用。用引物ITS1/ITS4对其rDNA的2个内转录间区和5.8S区段进行PCR扩增。每个反应体系体积为20 μL：10×PCR反应缓冲液2 μL，dNTPs （10 mmol/L） 1.6 μL，引物ITS1和ITS4 （10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O补足20 μL。用双蒸灭菌水代替模板DNA作阴性对照。PCR扩增反应在PCR扩增仪（Eppendorf Mastercyler gradient）上进行。扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取 5 μL PCR产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测，分析PCR产物片段大小，并用凝胶成像系统拍照保存。

1.2.4.2PCR产物的回收、克隆及测序PCR产物经电泳分离后，在紫外灯下切下含目的片段的琼脂糖凝胶，转入无菌的微量离心管，用胶回收试剂盒（OMEGA Gel Extraction Kit）回收纯化，具体操作步骤参见说明书；与T1载体连接后转化感受态DH5α。经蓝白斑筛选后，随机挑取5个白斑，利用通用引物M13F/R对待鉴定的菌液进行PCR鉴定。反应体系以及PCR扩增反应程序参照“1.2.4.1”节。反应结束后，取5 μL扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检查扩增结果。选取阳性克隆，提取质粒DNA，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1.2.4.3病原菌rDNA-ITS序列系统发育树的构建获得的序列在DNAStar中，利用ITS1、ITS4引物序列去除多余的载体序列。将所得序列在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行Blast比对及同源序列分析，并下载Phoma属的P. herbarum、P.omnivirens、P. eupyrena、P. schachtii、P. muscivora、P. haematocycla、P. polemonii、P. dutchum、P. multirostrata、P. aliena、P. costarricencis、P. sexea、P. destructiva、P. bulgarica、P. pereupyrena、P. matteuciicola、P. insulana、P. digitalis、P. crystallifera、P. acetosellae等20个种的37条rDNA-ITS序列。利用MEGA 4.0软件中邻接法 （neighbor-joining，NJ） 进行聚类分析，绘制出相应的系统发育树，重复次数为 1 000 次。

1.2.5病原菌生物学特性研究

1.2.5.1病原菌菌丝体生长特性测定将供试病原菌在PDA培养基平板上于28 ℃培养5 d，用无菌的打孔器在菌落边缘打取直径5 mm的菌饼备用。将菌饼接种于PDA平板中央，分别置于5、10、15、20、25、28、32、37 ℃以及40 ℃恒温培养箱中培养；另将接种供试菌株的PDA平板分别置于完全光照、完全黑暗、光/暗交替（18 W，1根灯管；光照和黑暗各 12 h）、暗/光交替（黑暗和光照各12 h）的28 ℃恒温条件下培养；用稀盐酸和氢氧化钠溶液将PDA培养基的pH值分别调节为4、5、6、7、8、9、10、11后制成PDA平板，将菌饼接种于不同pH值的平板中央，28 ℃恒温培养；用等量的碳源（麦芽糖、D-果糖、葡萄糖、乳糖和甘露醇）及氮源（蛋白胨、甘氨酸、牛肉浸膏、尿素和L-天冬酰胺）分别替换Czapek培养基中的蔗糖和硝酸钠，制成含不同碳氮源的Czapek培养基平板，分别以不含碳源（蔗糖）及氮源（硝酸钠）的培养基为对照，将供试菌株菌饼接种于平板中央，28 ℃恒温培养；所有处理均重复5次，培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径并计算菌丝体生长速率，用SAS软件对试验结果进行统计分析。

1.2.5.2病原菌致死温度和时间测定在含有2 mL无菌水的试管中加入供试菌株菌饼，分别在45、50、55、60、65 ℃的恒温水浴锅中加热10 min，20 min后迅速冷却，取菌饼接种在PDA培养基平板中央，28 ℃恒温培养，逐日观察菌丝体生长情况。

2结果与分析

2.1王草叶斑病田间发病症状

田间调查发现，该病主要危害王草叶片，在叶片边缘或尖端形成枯黄色条状斑点（图1-a，后期整个叶片黄化枯死并且变脆，有黑色小霉点形成（图1-b）。经室内分离后及单孢纯化得到3个菌株，编号分别为GX8-2、GX12、GX叶斑-2。经镜检表明，这3个菌株的培养性状、菌丝体及分生孢子形态等均相同，因此认为属于同一种真菌，故后续研究只对 GX8-2进行研究。

2.2病原菌的培养形状和形态学观察

菌株在PDA培养基上的菌落形态呈近圆形，有轮纹，边缘不均匀，菌落中央稍隆起，菌丝灰白色，生长旺盛，棉絮状（图2-a、图2-b）。经显微镜观察发现，菌丝表面粗糙、不平滑（图2-c），分生孢子器呈椭圆形，黑褐色，具孔口，表面不光滑，大小约为124.78 μm×92.99 μm（图2-d）；分生孢子呈卵圆形或椭圆形，无色单胞，大小为（5.16～6.92） μm×（2.56～3.54） μm （图2-e）。其型态特征与茎点霉（Phoma sp.）描述高度相符。

2.3致病性测定

将纯化后的单孢菌株GX8-2菌块接种至王草叶片上，2～3 d后，接种叶片均表现病症，接种发病症状与大田发病初期症状一致，但比大田自然发病初期症状严重（图3）。根据柯赫氏法则将发病组织进行再分离， 获得的分离物形态特征与原接种菌株一致，表明所获得的分离物为王草叶斑病的致病菌。

2.4病原菌ITS序列分析

利用引物ITS1/ITS4对菌株GX8-2的DNA模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测表明，该引物从基因组中扩增出1条特异性条带，其大小介于500～750 bp之间（图4）。经克隆测序最终获得534 bp rDNA-ITS序列，将该序列提交至GenBank数据库，获得序列登录号为KU324835。经Blast比对分析发现，该序列与数据库中已登录的Phoma herbarum（KJ767078.1，AB369456.1，KJ767079.1） 草茎点霉ITS

序列同源性达99%。通过与GenBank数据库中登录的20个Phoma属序列构建的系统发育树揭示，GX8-2与Phoma herbarum的同源性最高，聚为一个分枝（图5）。最终结合形态学观察结果，将GX8-2鉴定为草茎点霉（Phoma herbarum）。

2.5病原菌生物学特性

2.5.1病原菌菌丝体生长特性病原菌菌丝体生长特性测定结果表明，适宜草茎点霉菌菌株GX8-2生长的温度范围为25～32 ℃，最适生长温度为25 ℃，当温度低于10 ℃或高于37 ℃时，菌丝体生长受到抑制或无法正常生长（图6）；光/暗交替或暗/光交替条件最适宜菌丝体生长，完全黑暗或完全光照条件下菌丝体生长速率相对较慢（图7）；在供试的所有pH值下GX8-2菌丝体均能生长，最适宜菌丝体生长的pH值范围为5～8（图8）；该菌在含有葡萄糖、蔗糖和甘露醇的查氏培养基上生长状况良好且生长状况较一致，在含有乳糖的查氏培养基上生长受到一定的影响，菌丝体稀薄，在不含任何碳源的查氏培养基上生长时，菌丝体极其稀薄，肉眼几乎很难看到（图9）；该菌在含有不同氮源的查氏培养基上生长状况存在较大差异，在含有蛋白胨的培养基上生长最快，且菌丝密实，在含有尿素的培养基上生长最慢，在不含任何氮源的培养基上生长时菌丝稀薄，生长不旺盛（图10）。

2.5.2病原菌致死温度和时间菌株GX8-2经45 ℃处理10～30 min后仍然能在PDA平板上正常生长，但是在50 ℃及以上温度处理10 min后不能生长。由此表明，菌株 GX8-2 菌丝体的致死温度为50 ℃ 10 min。

3讨论

热带、亚热带地区多年生牧草资源十分丰富，而高温高湿的气候也非常适宜病原微生物的生长和繁殖，导致热带牧草病害普遍发生，严重影响牧草产量及干草质量。练启仙等2004—2005年对贵州花江地区王草病害调查结果表明，该地区有茎腐病（病原为Gibberella sp.）、褐斑病（病原为Alternaria sp.）、叶斑病（病原为Phoma sp.）、斑点病（病原为Epicoccum sp.）和纹枯病（病原为Rhizoctonia sp.）等典型病害[9-10]。郑丽等对海南省牧草病害调查结果表明，造成海南王草叶斑病病害的病原菌主要有Phoma sp.、Rhizoctonia oryzae、Curvular sp.、Drechslera sacchari和 Alternaria sp. 5种[11]。虽然国内对由Phoma sp.侵染王草引起的叶斑病早有记录，但未见对该病病原进行系统生物学研究的报道。

笔者从发生在广西横县地区王草叶斑病病叶上，分离得到1株致病菌GX8-2。经形态学观察和分子生物学鉴定将其鉴定为草茎点霉（Phoma herbarum），并对其生物学特性进行了初步研究。研究表明，适宜GX8-2菌株生长的温度范围为25～32 ℃，这与张翠英的研究结果[12]相符合，只有温度低于10 ℃或高于37 ℃时，菌丝体的生长才会受到抑制或无法正常生长；该病菌的适宜pH 值范围很广，酸或碱的条件对其菌丝生长影响不大；GX8-2菌株在含有葡萄糖、蔗糖和甘露醇的查氏培养基上生长状况良好且生长状况较一致，会产生红色素，与许爱清等报道的由镉诱导草茎点霉产生红色素的描述[13]类似；该病菌对碳氮源的要求不严格，仅是以尿素为氮源时病原菌的生长状况不太理想，说明该菌有很强的环境适应性。本次在广西横县暴发的王草茎点霉叶斑病发生情况十分严重，这可能与该病原菌对环境的适应性较强有一定的关系。

茎点霉属真菌种类繁多，且大部分是重要的植物致病菌，能侵染植物并引起叶斑、茎枯、根腐和果腐等症状[14-17]。在牧草上，多喙茎点霉（Phoma multirostrata）侵染多花筋骨草引起黑胫病，导致植株整株枯萎死亡[18]。苜蓿茎点霉（Phoma medicaginis）引起苜蓿黑胫病和叶斑病[19-21]，以及茎点霉（Phoma sp.）引起红豆草叶斑病[6]均有报道。不同病原菌侵染植物发生叶斑病的危害症状较为相似[22-24]，给病害诊断及病原鉴定带来了较大困难。是否可以根据不同的牧草叶斑病害开发出田间快速检测及诊断的方法，值得进一步研究。

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