基于乙肝病毒基因突变分析的乙肝个体化诊断与应用研究

石之驎　戴炜　曾辉　谢舒枝

[摘要] 目的 研究乙肝病毒基因突变分析在乙肝个体化诊断方面的临床应用。 方法 选取本院自2011年8月～2014年8月间收集的乙型肝炎病毒感染未使用药物者的外周血标本和肝癌患者术后病理标本工共120例，前者为甲组，后者为乙组，对标本进行已感染HBV BCP-PreC/C区基因突变与临床诊断的相关性研究，对测得的DNA基因序列通过HBV drug guide软件进行对比分析。 结果 研究结果现实，1762/1764位的基因突变与肝脏损伤呈正向相关；1896/1899位的基因突变与HBeAg呈负向相关。 结论 本次研究为乙肝病毒基因突变分析对于乙肝个体化诊断提供一定的临床依据。

[关键词] 乙肝病毒；基因突变；分析；乙肝个体化诊断；应用

[中图分类号] R512.62 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2016）09-124-04

[Abstract] Objective To explore the clinical application of hepatitis B virus （HBV） gene mutation analysis in the individualized diagnosis of patients with hepatitis B. Methods A total 120 cases of peripheral blood samples from hepatitis B patients without any drugs and pathologic specimens from liver cancer patients after operations which were collected in our hospital form August 2011 to August 2014 were divided into group A and group B respectively.The relationship between HBV gene mutation in the BCP-PreC/C segment and clinical diagnosis was studied， and the DNA gene sequences were compared and analyzed by the HBV drug guide software. Results Results indicated that， there was a positive correlation between liver injury and gene mutation in the 1762/1764 segment，and there was a negative correlation between HBeAg and gene mutation in the 1896/1899 segment. Conclusion This paper provides a clinical reference for the individualized diagnosis of hepatitis B patients based on hepatitis B virus gene mutation analysis.

[Key words] Hepatitis B virus （HBV）；Gene mutation；Analysis；Individualized diagnosis of hepatitis B；Application

乙型肝炎病毒是一种嗜肝、双链DNA病毒[1]。据调查显示，乙型肝炎病毒感染导致的乙型肝炎已经成为世界性的传染性疾病，居我国严重的传染病之首。世界上有20亿人感染过HBV，中国的乙肝患者及携带者就已高达9500多万，其中3000多万人为慢性乙型肝炎的患者，据调查显示，我国每年大约有50多万人死于本病及其并发症[2]，容易发生碱基配对错误，而导致HBV基因高突变的特性，进而产生耐药或感染进程改变等。本文通过研究乙肝病毒基因在我国的变异情况以及实际的临床相关性，为复杂的病毒感染检测提出指导思路，尽可能的提高病毒基因诊断的准确性和稳定性进行综述。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取院自2011年8月～2014年8月间本院收集的乙型肝炎病毒感染未使用药物者的外周血标本和肝癌患者术后病理标本共120例，其中标本来源于男79例，女41例，年龄在23～76岁，平均（48.7±8.2）岁。并对肝癌患者（或肝硬化患者）进行手术后取组织采取病理标本。

1.2 方法

对上述标本进行已感染HBV BCP-PreC/C区基因突变与临床诊断的相关性研究分析，对测得的DNA基因序列通过HBV drug guide软件进行对比分析。

1.3 统计学分析

本次研究使用SPSS14.0软件包对所得的数据进行处理分析，计数资料以百分比表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者1762/1764位基因、1896/1899位的基因突变的发生情况比较

通过HBV drug guide软件分析可见，HBV BCP-PreC/C区的基因在肝癌患者（或肝硬化患者）以及未用药组标本中存在1762/1764位的多发性基因突变，并且发现基因突变的平均比例>50%，主要以AST、AST值40U/L为界值，同时对比其他位点发现，1762/1764位的突变较未发生突变的样本差异有统计学意义（P<0.05），由此看来，1762/1764位的基因突变与肝脏损伤呈正向相关；分析结果发现，1896/1899位基因突变在为用药组HBeAg<1作为界限，对比分析1762/1764等其他的位点发现1896/1899位的基因突变与为发生突变的样本比较差异有统计学意义（P<0.05），由此看来1896/1899位的基因突变与HBeAg呈负向相关。见表1。

2.2 两组乙型肝炎病毒感染标志物分析

研究结果显示，两组患者乙型肝炎病毒感染标志物HBsAg+HBeAg+、HBsAg+抗-HBe、HBsAg+抗-HBc以及HBsAg+HBeAg+抗-HBc水平比较差异具有显著性，而肝癌患者HBsAg+抗-HBe+ 抗-HBc标志物明显多于乙型肝炎病毒感染者。详细的分析结果，见表2。

3 讨论

乙肝病毒是目前发现的危害人类健康较为严重的全球性传染病，据相关资料统计，我国的乙肝患者以及乙肝携带者高达9300万。其中大约有1/3为慢性乙型肝炎患者。我国每年大约有50万人死于HBV感染导致的干功能衰竭、肝癌、肝硬化等严重并发症，该病导致的死亡人数约占全部因感染导致死亡人数的一半，与其他国家相比，我国的乙型肝炎的感染率居全球首位，其在我国的感染率高达57.6%。乙肝病毒流行定义为携带慢性乙肝病毒患者的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）≥2%，并且携带6个月以上。目前，最常见的乙肝病毒分型方法主要是以HBV全基因序列核苷酸同源性和异源性进行分型。其分型标准是以全系列的异原性≥8%，或者根据HBV全序列中的S基因区异源性≥4%为乙型肝炎病毒基因S区分型标准，将HBV分为8种基因型及不同的亚型。不同的基因组间发生充足，主要发生在病毒基因组的核心区，并且不同基因组间重组主要发生在B基因型和C基因型之间。HBV基因型的分布具有一定的区域性。

乙肝病毒DNA的开放读框码具有高度重叠性，其主要氛围四个区域，即S基因区域、C基因区域、P基因区域以及X基因区域，其中的P基因区域编码的乙肝病毒DNA的聚合酶具有较高的复制特性，并且由于缺乏3-5外切酶的活性，DNA复制的过程中的逆转录酶缺乏3-5外切酶的活性，因此容易出现碱基配对出现错误的情况，最终可能导致乙肝病毒DNA基因发生基因突变，进一步导致耐药性或导致其发生感染。研究表明非编码区主要控制病毒的复制、翻译以及基因表达的过程。其对于下游表达的E、C抗原等存在重要的调控作用，该区域属于高突变区域，极其容易导致乙型肝炎病毒感染的发生、发展。此外还发现，该区域编码的X基因和X蛋白存在部分重叠，因此该区域可能发生X蛋白的改变。不同的乙肝病毒基因型对于乙肝的发展程度也存在一定的差异，目前临床虽然对本病的发病机制还不明确，但可以确定的是对乙型肝炎病毒治疗之前进行分型鉴定，有利于对疾病的治疗方案进行预估，并且还能实现相应的个体化治疗[3]。

乙型肝炎病毒的复制周期可分为两个阶段，第一个阶段为HBV的结合和入侵、核心颗粒入核、基因组脱壳以及形成cccDNA，第二个阶段则为病毒基因的转录与翻译、初级基因组RNA衣壳化、反转录、病毒颗粒的包装和分泌。

Peg-α-干扰素-2a（聚乙二醇化α-干扰素）和Peg-α-干扰素-2b可用于HBV的治疗[4]。其它能够抑制病毒的复制的核苷类逆转录酶抑制剂，包括阿德福韦（ADV）、恩替卡韦（ETV）、拉米夫定（LVD）、替比夫定（LDT）以及替诺福韦（TDF），以及氟化的拉米夫定，恩曲他滨（FTC）均可以用于治疗中。其治疗机制为：核苷类似物进入人体后，通过磷酸激酶的作用激化磷酸化，成为三磷酸核苷类似物，达到逆转录酶的活性和抑制病毒的DNA多聚酶的目的，并与核苷竞争性的掺入乙肝病毒的DNA链，来终止HBV DNA的合成和延长，最终抑制病毒的复制来发挥出抗病毒的作用核苷类似物药物能有效抑制病毒的复制但不能消除已有的病毒和cccDNA[5]。耐药所产生的基本理论在药物进入后，长期的压力下引起突变，对没有发生突变的病毒株进行了抑制，而突变的病毒株则逐渐的失控，最终引起病毒学突破的过程[6]。

拉米夫定具有安全、有效、耐受性好的特点，在临床的实验中用于治疗HBV感染，可能够有效的抑制HBV病毒载量，降低肝脏炎症，改善部分实验室指标，不过在随着用药时间的延长会导致具有抗性的乙型肝炎病毒[7]。其抗性有M204V/I/S改单一位置的突变导致，该位点存在于高度保守的聚合酶催化中心YMDD结构域，M204I的变异可直接发现，但同时伴有L180M突变，该位点的伴随性突变，能弥补增强乙肝病毒的复制能力，同时抵抗拉米夫定的抑制作用[8]。阿德福韦酯是乙肝病毒复制的强效抑制剂，只有微弱的HIV复制抑制的效果，因此被FDA批准为只作为治疗HBV感染的药物，其抗性的产生主要在HBV聚合酶的密码子rt181和rt236位置，当阿德福韦在与拉米夫定预先耐药患者与拉米夫定预先耐药的病毒株组合给药时，可同时诱发两种药物抗性，根据有关的细胞培养研究表明，N236T突变和A181V突变不造成对恩替卡韦的交叉耐药性。替诺福韦出能抑制HBV聚合酶外，也可用于治疗HIV感染[9]。研究表明，替诺福韦与拉米夫定联合应用进行治疗，比单独使用替诺福韦抑制HBV DNA复制更加的有效。更多的感染A基因型HBV的患者与非A基因型HBV感染的患者相比，具有更佳的药物应答效果[10]。目前，替诺福韦主要被用于HBV与HIV的共感染治疗中。拉米夫定和替诺福韦同时用药的方案治疗HBV和HIV共感染的患者，不被推荐为一线治疗HBV单一感染的患者使用[11]。

乙肝病毒载量和自然发生的突变株与乙肝病毒导致的慢性肝脏疾病的长期感染密切相关，在早期的研究资料中，发现C基因型的核心启动子区A1762T/G1764A与B基因型相比更加容易发生变异[12]。同时发现C基因型乙肝病毒患者的病毒载量明显高于B基因型患者，在这种高病毒载量的情况下，C基因型患者与其它基因型的患者相比，发生肝硬化的几率明显要高。本次研究也证实了这一说法[13]。各基因型间的慢性乙型肝炎发病机制具有一些差异，B和C基因型对比A和D的基因型当中，乙肝病毒DNA和乙肝核心抗原在细胞内的表达，以及乙肝病毒DNA和乙肝E抗原在细胞外的分泌表达，B和C基因型均高于A和D基因型[14]。细胞内积累的乙肝病毒DNA和抗原的导致较大肝细胞损伤。

经过大量的临床研究，多项研究已经明确S基因区的保守性较高，并且S区基因也是区分基因型的标志性基因区；研究表示，P基因区为耐药基因区，同时还与S区存在一定的交叉区域，可根据S区的保守性进行分析。有研究表示，BCP-P热C/C 基因区是突变的高发区域，这一高发的突变性导致其不具备基因分型的功能，这一区域的突变程度与肝性疾病的发展存在密切的关联。根据以上基因区对乙型肝炎病毒进行综合判断，乙型肝炎病毒的八种基因型均具有相对的保守性，并且还具有一定的分型特征。通过应用生物信息学分析的方法，目前已经初步建立乙型肝炎病毒基因检测的基因测序基础，也进一步为乙型相关性疾病的诊断提供可靠的参考依据。也最终为乙型肝炎病毒的分型以及耐药的研究利空检测路径[15]。通过本次研究也可以看出，通过对乙型肝炎病毒基因突变的诊断，可以对肝脏病变的程度进行区分，研究结果显示，1762/1764位的基因突变与肝脏损伤呈正向相关；1896/1899位的基因突变与HBeAg呈负向相关。本次选取的乙型肝炎病毒感染者的1896/1899位的基因突变率明显低于肝癌患者1896/1899位的基因突变率（51.67%vs90.0%）；而1896/1899位的基因突变比较则发现，肝癌患者的突变率明显低于乙型肝炎病毒感染者（70.0%vs88.33%）。

综上所述，乙肝病毒基因突变分析对于乙肝个体化诊断提供一定的临床依据。

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（收稿日期：2016-01-05）