油菜油体蛋白基因启动子的克隆及在油葵中的功能验证

邵铁梅++安胜军+仵陶+焦展++李雪++刘培++柴锡庆+高维娟

摘要：利用PCR技术，从油菜（Brassica campestris）基因组DNA中克隆20 ku油体蛋白基因上游903 bp 的调控序列NOP，将其与GUS基因融合构建植物表达载体，利用花粉管通道法转化油葵并进行PCR扩增，组织化学染色检测启动子和GUS基因在油葵基因组中的整合和表达情况。结果表明，NOP序列1～903 bp与报道序列同源性为95%，包含驱动基因表达的重要元件及驱动基因在种子中特异表达所必需的核苷酸序列；目的片段已整合到油葵基因组中，NOP具有种子特异性启动子的功能，能够驱动GUS基因在油葵种子中特异性表达，而在油葵根、茎、叶中均不表达。

关键词：油葵；烟草；种子特异性启动子；GUS染色；油体蛋白基因

中图分类号： Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0071-02

收稿日期：2015-12-23

基金项目：河北省高等学校科学技术研究重点（编号：ZH2011208）；河北省人力资源和社会保障厅 2011年度河北省人才工程培养（编号：35）；河北省高等学校科学技术研究重点（编号：ZD2010216）。

作者简介：邵铁梅（1974—），女，河北徐水人，博士，副教授，主要从事植物生物反应器生产蛋白类药物研究。 Tel：（0311）85110321；E-mail：836311038@qq.com。

通信作者：高维娟，博士，教授，主要从事植物生物反应器生产蛋白类药物研究。Tel：（0311）83938058；E-mail：gwj6088@163.com。植物油体表达体系是以种子特异性基因为启动子，驱动目的蛋白基因与油体蛋白基因在植物油体中融合表达，获得转基因植物种子，粉碎种子并离心，回收上层油，利用油体亲脂疏水性去除种子中大部分非目标成分，进一步获得纯化的目的蛋白，使蛋白的分离纯化成本得到显著降低[1]。油用向日葵（Helianthus annuus L.）简称油葵，是世界第二大油料作物，也是我国四大油料作物之一[2]，因其产量和含油率高，被认为是构建植物油体表达体系较为理想的植物。另外，油葵是一种耐旱作物，可在盐碱地、干旱地区甚至沙漠等恶劣环境下种植，不仅不会与粮食“争地”，还有利于提高我国山岭薄地、干旱贫瘠地块的利用率，适于大面积推广，有助于缓解我国耕地紧张的压力。目前，成功用于构建植物油体表达体系的种子特异性启动子有油菜（Brassica campestris）油体蛋白基因启动子、菜豆蛋白基因启动子、拟南芥油体蛋白基因启动子等。油菜油体蛋白基因启动子驱动一种新型降钙素基因，与芝麻油体蛋白基因在棉花种子和油菜种子中成功融合表达[3]；菜豆蛋白基因启动子驱动拟南芥18 ku油体蛋白单链抗体和阿朴脂蛋白AI米兰突变体，与融合基因在红花种子中表达[4]；拟南芥油体蛋白基因启动子驱动拟南芥油体蛋白基因和水蛭素基因在油菜种子中融合表达[5]。驱动外源基因在油葵种子中特异表达的研究比较少。

油菜是我国非常重要的油料作物，油菜籽含油量高达42%～45%，油菜20 ku油体蛋白是24 ku油体蛋白含量的10倍，贾世荣等成功利用20 ku油体蛋白基因在油菜和棉花种子中驱动外源基因的表达[3]。本试验从油菜基因组DNA中克隆油菜20 ku油体蛋白基因上游903 bp的调控序列NOP，构建植物表达载体并转化油葵，经检测，该启动子能驱动GUS基因在油葵种子中的特异表达。这为油葵植物生物反应器的构建提供了优良的备选启动子资源，同时也为油葵的油脂基因工程改良提供了候选启动子。

1材料与方法

1.1试验材料、菌株与质粒

植物材料为“精选”油葵品种的恢复系，由河北华丰种业开发有限公司惠赠。双元表达载体pBI121：GUS，由pCAMBIA1301中的GUS基因替换pBI121中的GUS基因，河北化工医药职业技术学院实验室构建保存；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞，购自博迈德生物科技有限公司；限制性内切酶、连接酶，购自宝生物工程（大连）有限公司；KOD-plus，购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶，购自鼎国生物技术公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒，购自天根生物科技（北京）有限公司；卡那霉素 （kanamycin），购自Roche公司。

1.2油菜基因组的提取

采用SDS法[6]提取油菜基因组。

1.3PCR扩增和植物表达载体pNOP：GUS的构建

依据GenBank发表的油菜20 ku油体蛋白基因启动子（序列号：AF134411）设计上下游引物，引物为：NOP F：5′-CCCAAGCTTTTCAACGTGGTCGGATCATGACG-3′；NOP R：5′-CGC-GGATCCGAATTGAGAGAGATCGAAGAG-3′（下划线为酶切位点）；在上下游引物上分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点，以油菜品种青油14的基因组DNA为模板，扩增油菜油体蛋白基因启动子；PCR扩增产物经限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶处理，插入pBI121：GUS的HindⅢ位点和BamHⅠ位点之间，获得植物表达载体pNOP：GUS；对2个阳性克隆由上海生物工程技术有限公司进行测序验证。

1.4油葵的转化

参照刘芳等的方法[7]，采用花粉管通道法转化精选油葵恢复系。

1.5转基因油葵的PCR检测与组织化学分析

以SDS 法小量提取转基因油葵T1代幼苗基因组DNA为模板，NOP F、NOP R为引物进行PCR 检测，鉴定获得转化植株；依据Rueb等的方法[8]，对转化植株的根、茎、叶、种子进行GUS检测，以验证NOP启动子的功能。

2结果与分析

2.1启动子片段的克隆、植物表达载体pNOP：GUS的构建及启动子序列分析

试验结果表明，以油菜青油14品种基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测发现，扩展产物有1条约0.9 kb的扩增条带，将该片段插入pBI121：GUS的HindⅢ和BamHⅠ位点之间，可获得植物表达载体pNOP：GUS，经HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定，获得预期大小0.9 kb的目的片段（图1），这说明该植物表达载体构建正确。将NOP 核苷酸序列在NCBI中运用Blast进行比对，结果显示，NOP与油菜油体蛋白基因的启动子序列同源性为95%，这说明NOP是油菜20 ku油体蛋白基因的启动子。NOP 核苷酸序列经Place数据库查询分析，结果表明，此序列包含TATA-box，可能序列为ATATAT，位于817～822位，主要功能是保证转录得以精确起始；包含ABRES元件，可能序列为ACACGTGGC，位于758～766位，在生长组织中介导脱落酸（ABA） 应答，是种子成熟阶段不可缺少的顺式调控元件之一；含有1个G-box，可能序列为TGACGTGG，位于536～543位，这在种子特异性启动子中普遍存在，高度保守，是光调控的应答元件，对种子特异基因的表达在时间和空间上起到重要的顺式调节作用，发生突变的种子特异性启动子将丧失大部分活性[9]；包含2个CAAT-box，可能序列为CAAAT，位于669～673、359～363 位，存在比较广泛，与基因表达的种子特异性和活性相关，主要起数量调节作用[10-11]；包含1个I-box，序列为TTTCAAA，位于666～672位。

2.2转基因油葵的获得

经花粉管通道法转化精选油葵恢复系，将收获的种子进行种植，每株取幼嫩真叶提取基因组，PCR检测，结果表明，扩增产物得到约0.9 kb的特异条带，与以pNOP：GUS为模板的阳性对照扩增结果一致，这初步说明目的片段已整合到油葵基因组DNA中。

2.3转基因油葵的GUS检测

为验证所克隆启动子的功能，取转基因油葵植株不同部位的组织进行GUS检测，结果表明，启动子驱动下的基因不能在油葵根、茎和叶中表达，只能在油葵种子中表达（图2）。这说明油菜油体蛋白基因启动子可以驱动外源基因在油葵种子中特异表达。

3结论与讨论

油菜籽粒含油量高，20 ku油体蛋白是24 ku油体蛋白含量的10倍，因此，20 ku油体蛋白基因的启动子被推测是一个较强的种子特异性启动子，朱亚兰等克隆了该基因并构建了植物表达载体[12]。本试验从青油14中克隆了油菜油体蛋白启动子，包含基因表达的重要特征元件及TATA-box、ABRES、G-box、I-box、CAAT-box等种子特异表达所必需的核苷酸序列，与GenBank中序列号为AF134411的油菜 20 ku 油体蛋白基因启动子同源性为95%，与刘昱辉等克隆到的油菜油体蛋白基因启动子[13]同源性为100%。在此基础上，构建油菜油体蛋白启动子与GUS基因融合表达载体，转化油葵，经组织化学染色，结果表明，该启动子可以驱动GUS基因在油葵种子中的特异表达，这为油葵利用转基因技术构建生物反应器和油脂基因工程改良奠定了基础。

本研究选用花粉管通道法转化油葵，该方法有效地利用了自然生殖过程，可直接得到转化种子，无需进行繁琐的组织培养。但是，花粉管通道法也有缺点，由于将基因导入受体基因组会引起性状的大量分离，需要经过多代的自交纯化，才能得到目标性状稳定的纯合后代[14]。本试验主要目的是为研究油菜油体蛋白基因启动子能否驱动外源基因在油葵种子中的特异性表达，采用花粉管通道转化是一种较快较好的选择，且也获得了比较理想的试验结果。

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