H9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定

司振书+贾国富

摘要：H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是危害我国养禽业的主要病毒之一，造成了严重的经济损失。根据H9亚型AIV的HA基因设计了1 对引物，建立了H9亚型禽流感病毒的RT-PCR鉴定方法。H9亚型AIV的HA基因预期扩增的目的片断长度为425 bp。对H9N2亚型禽流感病毒不同稀释度的尿囊液进行检测，证实病毒尿囊液的最低检出量为1×104.25EID50/100 μL。建立的RT-PCR检测方法对H9、H3、H4、H5亚型AIV及新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等进行检测，结果仅有H9N2亚型AIV出现特异性目的条带，其他均未出现目的条带，与其他常见禽病病原无交叉反应；用建立的RT-PCR和病毒分离2种方法同时对10株H9N2亚型AIV和8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品进行检测，结果2种检测方法的符合率达100%。说明该鉴定方法特异性强，敏感性较高。

关键词：禽流感病毒；H9亚型；鉴定

中图分类号： S855.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0064-02

收稿日期：2015-05-15

基金项目：聊城大学博士启动基金（编号：318051310）；山东省农业良种工程重点课题（编号：25114426）。

作者简介：司振书（1971—），女，山东冠县人，博士，副教授，研究方向为预防兽医。E-mail：dckszs@163.com。禽流感病毒（AIV）的核酸为单股负链RNA，由8个独立的RNA节段组成[1]，变异频繁，亚型众多。H9亚型禽流感病毒为低致病力毒株，特点是分布广泛，能造成鸡群的免疫抑制，如果与禽传染性支气管炎病毒、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等其他病原协同感染则可引起禽类严重发病。近十几年来，H9亚型禽流感在我国呈上升趋势，严重危害了我国养禽业发展，影响畜产品的国际贸易，同时还给人类健康带来威胁。研究表明，H9N2亚型AIV为1997年引起香港流感的H5N1亚型AIV提供了内部基因[2]，1999年，发生了H9N2亚型AIV感染人事件[3]，2013年我国发生了H7N9感染人事件，6个内部基因全部来自于H9N2 AIV[4-5]。所以，H9N2亚型AIV公共卫生意义引起了全世界广泛关注。传统检测H9亚型AIV的方法主要是病毒分离培养与血凝抑制试验（HI），费时费力，需要多种亚型的血清和抗原，不能及时对病毒进行鉴定或作出诊断。根据H9亚型AIV的HA基因设计了1对引物，初步建立了1种针对H9亚型AIV的检测方法，既可对H9亚型AIV快速、准确地鉴定，又可用于H9亚型AIV的流行病学调查。

1材料与方法

1.1毒株

H9N2亚型AIV、H3N8亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N1亚型AIV、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性法氏囊炎病毒（IBDV）、鸡新城疫病毒（NDV）等毒株由中国农业大学动物流感研究室保存并提供。

1.2引物的设计、合成与筛选

根据H9亚型禽流感病毒的HA基因的序列，通过DNAman 软件进行比对，找出HA基因的保守区，针对HA基因的保守区序列设计特异性引物，并在Genbank上进行Blast检测比对分析，用Oligo 4.0软件分析上下游引物是否匹配，将分析合格的引物送上海生工生物技术有限责任公司北京合成部合成。合成了针对HA基因的5对引物，用中国农业大学流感研究室分离保存的H9N2亚型AIV进行筛选，根据扩增效率确定引物对。确定上游引物H9-F：5′-TGTGGCAACTGAAGAAAT-3′；下游引物H9-R：5′-ACCAACCTCCCTCTATGA-3′；退火温度为53 ℃。目的片断长度为425 bp。

1.3主要试剂

TRIzol Reagent 由invitrogen公司生产；反转录试剂盒K1622，Fermentas；氯仿、异丙醇、乙醇等均为市售；GoldenView由北京索莱宝公司生产。

1.4H9N2亚型AIV病毒含量的测定

取感染H9N2亚型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/2007的尿囊液，作10倍倍比稀释，每个稀释度接种3枚鸡胚（0.1 mL/枚）。35 ℃孵育48 h，将鸡胚于4 ℃过夜，收获尿囊液，测定其血凝效价，按Reed-Muench法计算半数感染量。

1.5病毒RNA的提取与cDNA的合成

取感染H9N2亚型AIV毒株A/CK/SD/ZB/2007的鸡胚尿囊液Trizol法提取病毒的总RNA，将干燥的RNA用11 μL DEPC 水溶解，立即做RT-PCR的扩增或-80 ℃保存备用。

将Unit 12（10 μmol/L）1 μL加到含RNA的11 μL DEPC 水中，瞬时离心，70 ℃水浴5 min后，置冰上5 min。依次加入5×AMV buffer 5 μL，dNTPs（10 mmol/L） 2 μL，RNasin （40 U/μL） 1 μL，MLV （5 U/μL） 1 μL，混匀，瞬时离心，37 ℃ 水浴1 h，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.6反应体系和反应条件的优化

对RT-PCR反应体系和变性、退火、延伸温度和时间、循环次数等条件进行优化，最后确定采用总体积为 25 μL 的反应体系：2×PCR MIX buffer 12.5 μL；浓度为 20 pmol/μL HA上游引物H9-F 1 μL；HA下游引物H9-R 1 μL；cDNA 2 μL；ddH2O补足至25 μL。最后确定RT-PCR最佳循环条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火35 s，72 ℃ 延伸35 s，34个循环；然后72 ℃延伸10 min。

1.7产物分析与测序

用最佳反应体系及条件对毒株A/CK/SD/ZB/2007进行PCR扩增，将产物进行回收纯化，送北京华大基因科技股份有限公司测序。

1.8特异性试验

用建立的RT-PCR方法分别对H9N2亚型、H3N8亚型、H4N6亚型、H5N1亚型AIV及ILTV、IBV、IBDV、NDV的鸡胚尿囊液进行PCR扩增，分析该检测方法的特异性。

1.9敏感性试验

对已确定病毒含量的毒株A/CK/SD/ZB/2007的尿囊液进行100、10-1、10-2、10-3、10-4等不同稀释度稀释。对不同稀释度尿囊液进行PCR扩增，分析该检测方法的敏感性。

1.10RT-PCR检测方法的应用

取经HI常规方法鉴定的H9亚型AIV感染鸡的组织样品8份，称量，研磨，加含双抗的PBS制成10%～20%质量分数的悬液。4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清接种10日龄SPF鸡胚，收集24～72 h死亡及未死亡的鸡胚尿囊液。对实验室保存的10株H9N2亚型AIV及以上8个样品分别用该方法进行PCR扩增。

2结果与分析

2.1病毒含量的测定结果

经测定H9N2亚型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/2007的尿囊液，病毒含量为1×107.25EID50/100 μL。

2.2扩增结果

H9N2亚型AIV A/CK/SD/ZB/2007的扩增结果见图1。获得了425 bp的目的条带，与预期产物大小相符。

2.3测序结果

将HA基因扩增片段测序结果在NCBI流感数据库中进行Blast比对，HA基因序列与A/Chicken/Shandong/A1/2009（H9N2）、A/Chicken/Zhejiang/611/2011（H9N2）等毒株的第4个片段HA基因的同源性为99%。

2.4特异性试验结果

H9N2亚型AIV扩增出425 bp的目的条带。而NDV、H3N8亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N1亚型AIV、ILTV、IBV、IBDV的尿囊液样品均无条带出现（图2）。结果表明，该方法对H9亚型AIV进行检测具有很强的特异性，可特异性地检出H9亚型AIV。

2.5敏感性试验结果

对病毒含量为1×107.25EID50/100 μL的病毒A/CK/SD/

ZB/2007的尿囊液进行10倍倍比稀释，分别提取RNA，用该方法检测，扩增结果见图3。在10-3稀释时仍然可以扩增出明显的目的条带，说明该方法对病毒尿囊液的最低检出量为1×104.25EID50/100 μL，灵敏度较高，敏感性较强。

2.6RT-PCR检测方法的应用

对10株H9N2亚型AIV和8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品用该方法进行检测，结果（图4）表明，各毒株与样品均扩增出了425 bp的条带，大小与预期相符，表明所建立的RT-PCR检测方法的鉴定结果与HI等常规方法相比符合率为100%。

3讨论

H9N2亚型AIV在我国鸡群中分布广泛，并能引起人类感染，给养禽业和公共卫生造成重大影响，能对其快速准确地进行鉴定非常重要。本研究根据H9N2亚型禽流感病毒的

HA基因和NA基因的保守区序列各设计1对引物，初步建立了针对H9N2亚型禽流感病毒的RT-PCR快速诊断方法，建立的RT-PCR检测方法对H3、 H4、H5、H9等亚型流感病毒、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒等进行检测，只有H9N2亚型AIV出现特异性目的条带，其他亚型AIV与NDV等无任何条带，说明该方法对其他亚型AIV及NDV等无交叉反应，具有特异性；通过对H9N2亚型AIV不同稀释度进行检测，证实病毒尿囊液的最低检出量为1×104.25EID50/100 μL，说明该检测方法特异性强，敏感性较高；对10株H9N2亚型AIV及8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品进行检测，其结果与经典的HI试验鉴定符合率为100%。该方法可对H9亚型AIV进行快速鉴定，为试剂盒的研制打下了良好基础，在兽医临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。

参考文献：

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