中药杜仲炮制方法及与续断不同配伍的化学研究

李霓，丁盛，何昌国

(1.浙江省临海市中医院 药剂科，浙江 临海 317000；2.杭州胡庆余堂药业有限公司 技术品质部，浙江 杭州 310026)

中药杜仲炮制方法及与续断不同配伍的化学研究

(1.浙江省临海市中医院 药剂科，浙江 临海 317000；2.杭州胡庆余堂药业有限公司 技术品质部，浙江 杭州 310026)

目的 分析并研究中药杜仲炮制方法及与续断不同配伍的化学变化，为杜仲复方配伍提供科学的参考依据。方法 分别采取清炒法、砂炒法和烘烤法来炮制杜仲样品，对比分析3种炮制方法的结果，然后采用薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)法、UV光谱法和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)对烘烤法炮制前后杜仲化学成分的变化情况。结果 经比较，烘焙法虽然需要的时间较长(107 min)，但其断丝率和成品率分别为(97.89±0.52)%和(89.75±0.93)%，明显高于清炒法(32 min)的(86.15±0.33)%和(54.00±0.84)%(P<0.05)，以及砂炒法(6 min)的(92.31±0.64)%和(64.73±0.71)%(P<0.05)，且损失率为(9.64±0.98)%，显著低于其他2种方法的(45.65±0.73)%和(31.43±0.79)%(P<0.05)。经炮制，杜仲的木脂素类和环烯醚类等化学成分明显减少(P<0.05)，但杜仲胶、微量元素、氨基酸和其他成分的变化并不显著。杜仲和续断的配伍比例会对生品配伍以及炮制品配伍中的绿原酸含量产生影响，2者关系密切。结论 中药杜仲炮制配伍化学成分的变化和炮制与配伍的方法具有密切关联。

杜仲；炮制；续断；配伍；化学研究

单味中药按照一定的中药理论进行配伍和加工，最终形成的药剂就是中药复方药剂。在构成复方药剂的各种药物中，判断某一种药物是否有效，或者是否存在有效的药物，可以从中药配伍的化学成分中展现出来，都需要进行深入的研究和分析。随着我国科学技术的迅速发展，先进的分析仪器不断涌现出来，极大地促进了药物有效成分的检测、分离、含量检测和分析的发展和进步。从临床实践来看，汤剂是中药复方药剂的主要类型，那么汤剂中所有化学成分的总和就是中药复方药剂药效的物质基础[1-2]。当然，在煎煮的过程中，不同的药材在经过配伍之后，其中的化学成分一定会发生变化，但是只有各种化学成分以合理的浓度进行搭配才能充分发挥药效。本实验选取杜仲和续断作为主要研究对象。其中续断属于川断科植物——川续断的干燥根，在临床中的应用比较常见，具有非常显著的续筋接骨和补肝益肾的作用。生物碱、挥发油和三萜皂苷等是其最主要的化学成分[3]。续断的主要药理作用为：抵抗骨质疏松、促进骨损伤的快速愈合等。同时，续断还会对免疫系统造成一定的影响。另外，在习惯性流产、先兆流产以及腰椎骨质增生类疾病的临床诊疗中，续断也具有较高的临床应用价值。为了研究中药杜仲炮制配伍的化学变化，为杜仲复方配伍提供科学的参考依据，本文进行了如下报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 杜仲、续断均购买于安徽毫州市朱氏药业有限公司(杜仲批号：151201，续断批号：160101)，并经临海市中医院主任中药师何昌国鉴定属正品；薄层色谱分析仪购买于雅特隆公司(型号：IATROSCAN MK6/MK6s)；UV光谱分析仪购买于厦门中治自动化工程有限公司(型号：CAT.NO.SA)和高效液相色谱分析仪购买于上海仪电分析仪器有限公司(型号：LC-200)；绿原酸标准品购置于大连美仑生物有限公司(批号：20151154)，甲醇(批号：160213)、醋酸(批号：151204)均购买于中海南联能源有限公司。

1.2 方法

1.2.1 炮制杜仲：炮制杜仲的方法有很多，在本次研究中分别采用清炒法、砂炒法和烘烤法来炮制杜仲样品，对比分析3种炮制方法的结果，然后采用薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)法、UV光谱法和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)对烘烤法炮制前后杜仲化学成分的变化情况。

1.2.2 清炒法、砂炒法和烘烤法比较：清炒法炮制时间为32 min，砂炒法炮制时间为6 min，烘烤法炮制时间为107 min。断丝率=断丝个数/总个数；成品率=样品处理后达标个数/总个数；损失率=(总量-剩余有效量)/总量。以上实验独立重复3次。

1.2.3 炮制前后化学成分变化：检测炮制前后木脂素类、环烯醚类、杜仲胶、微量元素、氨基酸、其他成分含量，具体方法：分别采用光谱法测定木脂素类含量，用比色法测定环烯醚类含量，用高效液相色谱法测定杜仲胶、微量元素以及氨基酸等成分含量。以上检测均重复3次。

1.2.4 高效液相色谱法测定杜仲中绿原酸方法的建立

① 准备实验仪器和相关试剂：高效液相色谱仪、自动进样器、UV检测器、超声波清洗器、烘箱、甲醇、醋酸为色谱纯[4]。

② 制备溶液：精密称取一定量的绿原酸标准品，用浓度为70%甲醇溶液配制成浓度为0.0511 mg/mL的标准品溶液。取2 g杜仲生品及炮制品放置在锥形瓶中，对其进行精密测定，加入40 mL浓度为50%的甲醇溶液[5]。进行0.5 h的超声处理，将超声温度参数设置为25 ℃，过滤，将其续滤液浓缩干燥，用浓度为70%的甲醇溶液在10 mL容量瓶中进行定容，等待检测。③选择检测波长：对190～700 nm扫描的各波长下的色谱图进行分析比较，在327 nm时色谱峰噪声较小、峰形较好，同时结合杜仲中的主要有效成分绿原酸的吸收波长，确定检测波长为327 nm[6]。实验重复测量3次。

1.2.5 不同配伍比例对绿原酸含量的影响：本研究采用醇溶法对绿原酸进行提取：先用氯仿进行连续提取至流出液呈无色，再改用95%工业乙醇提取提尽绿原酸。将所得乙醇提取液减压浓缩成浸膏,与干净细沙拌合后,用热水提取数次,使绿原酸转溶于水中,弃去残渣；所得水溶液用乙醚萃取,进一步除去脂溶性杂质;向脱脂后的水溶液中加入饱和硫酸铜溶液,至沉淀完全,并稍有过量为止。此时,水中的绿原酸与金属离子结合生成不溶性盐;用离心分离法分离出沉淀并除去沉淀中的金属离子后将所得滤液用有机溶剂萃取数次,回收溶剂,得绿原酸粗品,经分步结晶和重结晶等方法精制,即得绿原酸纯品。

① 标准曲线绘制：精密称取绿原酸标准品80 mg，用95%乙醇溶解，转移到250 mL容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混匀。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL到250 mL容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混匀，此为标准系列溶液。330 nm处测定吸光度，以绿原酸标准品的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘标准曲线，并求出相应的回归方程。

② 样品中绿原酸含量测定:准确称取中草药提取物样品各1.083 5 g，置于250 mL锥形瓶中，量取50 mL 95%的乙醇溶解样品，并置于85 ℃的恒温水浴箱中，回流4 h。冷却至温，过滤，然后加95%的乙醇将提取液定容于250 mL容量瓶，待用；准确吸取样品提取液5 mL于25 mL容量瓶中，加95%的乙醇稀释到刻度，得到待测样品液。以95%的乙醇作空白，在327 nm处测定吸光度，由标准曲线计算出待测样品液浓度。

③ 回收率测定：准确称取中草药提取物样品0.20 g，分别加入一定量的绿原酸标准品，按上述操作方法进行，用紫外分光光度法测定吸光度，得出绿原酸含量，计算回收率。以上实验重复3次。

2 结果

2.1 炮制结果比较 经比较，烘焙法虽然需要的时间较长，但其断丝率和成品率，明显高于清炒法以及砂炒法，且损失率显著低于其他2种方法。组间各指标均存在显著差异，具有统计学意义(P<0.05)。具体数据如表1所示。

表1 3种炮制方法的基本结果比较Tab.1 Comparison of three kinds of processing methods(±s,n=3)

*P<0.05，与清炒法比较，compared with stir-fried；#P<0.05，与砂炒法比较，compared with sand fry

2.2 烘烤法炮制前后的化学成分变化 经炮制，杜仲的木脂素类和环烯醚类等化学成分明显减少(P<0.05)，但杜仲胶、微量元素、氨基酸和其他成分的变化并不显著。具体数据如表2所示。

表2 烘烤法炮制前后各种化学成分的变化情况Tab.2 The changes of every chemical compositions pre- and post-treatment of baking method(±s，n=3)

ΔP<0.05，与炮制前比较，comparedwithpre-processing

2.3 不同配伍比例对绿原酸含量的影响 经研究分析可知，杜仲和续断的配伍比例会对生品配伍以及炮制品配伍中的绿原酸含量产生影响，2者关系密切。具体数据如下表3所示。

表3 不同配伍比例对绿原酸含量的影响Tab.3 The effect of different compatibility proportion on chlorogenic acid

3 讨论

在本次研究中，烘焙法虽然需要的时间较长，但其断丝率和成品率及损失率，显著优于其他2种方法，组间各指标均存在显著差异，具有统计学意义(P<0.05)。这一研究结果表示，在对中药杜仲炮制配伍进行化学研究时，烘烤法是炮制杜仲的首选方法，对于提高检验的准确性具有显著优势。同时，经炮制，杜仲的木脂素类和环烯醚类等化学成分明显减少(P<0.05)，但杜仲胶、微量元素、氨基酸和其他成分的变化并不显著。这一研究结果表明，炮制前后，杜仲的化学成分会发生一定的变化，尤其是木脂素类和环烯醚类等成分的变化，可以有效提高杜仲的药理作用[7]。

另外，本组的研究结果还显示：经研究分析可知，杜仲和续断的配伍比例会对生品配伍以及炮制品配伍中的绿原酸含量产生影响，2者关系密切。同时，我们还可以从表3看出，如果2者的配伍比例相同，炮制品配伍所得到绿原酸含量 要略高于生品配置，但差异并不具有统计学意义。因此，可以进行如下推论：杜仲不能直接入药，只有经过炮制后才能入药。当杜仲与续断在1:1时绿原酸含量最低，在各个配伍比例中杜仲的量是相同的，且随着续断加入量的改变绿原酸含量均有所增加。综上所述，中药杜仲炮制配伍化学成分的变化和炮制的方法具有密切关联。

[1] 高飞，傅超美，胡慧玲，等.关于中药炮制机制研究现状与发展趋势的思考[J].中国实验方剂学杂志，2013，5(30):352-355.

[2] 越皓，皮子凤，赵宇峰，等.电喷雾串联质谱分析附子炮制中的化学成分变化[J].分析化学，2011，13(7):959-963.

[3] 崔景朝，赵自明.中药配方颗粒研究进展(Ⅱ)——中药单煎与合煎对比研究概况[J].中国实验方剂学杂志，2011，26(4):240-245.

[4] 吕邵娃，董书羽，郭玉岩，等.数据分析技术在中药谱效关系中的应用进展[J].中国实验方剂学杂志，2015，10(15):226-230.

[5] 孙娥，徐凤娟，张振海，等.基于化学成分转化-肠吸收屏障网络耦联作用的中药炮制机制研究体系的构建[J].中国中药杂志，2014，12(3):370-377.

[6] 秦昆明，王彬，陈林伟，等.代谢组学在中药现代研究的应用与展望[J].中国中药杂志，2014，9(16):3010-3017.

[7] 尉芹，韩建国，董娟娥，等.不同炮制方式对中药材杜仲叶品质的影响[J].中国中药杂志，2011，24(1):85-87.

(编校：王俨俨)

Chemical research on different processed methods ofEucommiaulmoidesand compatibilities withHimalayanTeaselRoot

LI Jiao-ni1Δ, DING Sheng2, HE Chang-guo1

(1.Department of Pharmacy, Linhai Hospital of Traditional Chinese Medicine, Linhai 317000, China; 2.Department of Technology and Quality, Hangzhou Huqingyutang Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 310026, China)

ObjectiveTo analyze and study the chemical research of different processed methods ofEucommiaulmoidesand compatibilities withHimalayanTeaselRoot, provide scientific reference for extraction of compound compatibility.MethodsTheEucommiaulmoideswas respectively processed by stir-fried, sand fry and baking method, and the three methods were compared.Then the chemical constituent change were detected by thin-layer chromatography (TLC), UV spectrometry and high performance liquid chromatography (HPLC) for baking method before and after processing.ResultsAlthough baking method needs a longer time of 107 min, but the rate of broken wires and yield were (97.89±0.52)%and (89.75±0.93)%, which were significantly higher than the stir-fried method of(86.15±0.33)% and (54.00±0.84)%, and the method of sand fry of (92.31±0.64)% and (64.73±0.71)%, and the loss rate was (9.64±0.98)%, which was significantly lower than other two methods of 4(45.65±0.73)% and (31.43±0.79)%, with significant differences between groups (P<0.05).After processing, cortex eucommiae lignans and cycloalkene ether chemical components decreased significantly (P<0.05), while the gutta-percha, trace elements, amino acids and other ingredients, with no significant difference.The compatibility proportion ofEucommiaulmoidesandHimalayanTeaselRoot affected chlorogenic acid content,with the close relationship.ConclusionThe change of chemical composition and different processed methods and compatibilities is closely related.

Eucommiaulmoides; processing;HimalayanTeaselRoot; compatibility; chemical research

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.055

李峧霓，通信作者，男，本科，主管中药师，研究方向：中药炮制与中药药理，E-mail:lijiaoni1208@163.com。

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