8个新疆扁桃S-基因多态性与生物信息学研究

郭春苗，杨波，吐迪·麦麦提，李宁，唐亚萍，龚鹏，王继勋

(1新疆农业科学院园艺作物研究所/农业部新疆地区果树科学观测试验站，乌鲁木齐　830091；2新疆莎车县林业局，新疆莎车　844700)



8个新疆扁桃S-基因多态性与生物信息学研究

郭春苗1，杨波1，吐迪·麦麦提2，李宁1，唐亚萍1，龚鹏1，王继勋1

(1新疆农业科学院园艺作物研究所/农业部新疆地区果树科学观测试验站，乌鲁木齐830091；2新疆莎车县林业局，新疆莎车844700)

摘要：【目的】自交不亲和基因(S-基因)在果树及授粉树选配和自交亲和性品种选育等方面具有重要意义，是影响扁桃繁殖性状的重要候选基因，对8个新疆扁桃S-基因序列、基因结构、基因多态性进行研究。【方法】采用Blast、ProtParam和SignalP等生物信息学软件，对8个新疆扁桃S-基因的理化性质、多态性、系统发生树和蛋白结构等进行分析。【结果】新疆扁桃S氨基酸存在信号肽，不是分泌性蛋白，具有跨膜结构，推测S氨基酸可能定位于细胞膜中发挥功能；通过进化树分析，分为两大类群；二级结构由无规则卷曲、α螺旋和延伸链等结构元件组成。【结论】8个新疆扁桃S-基因的理化性质、多态性、系统发生树和蛋白结构等生物信息学分析结果将为S-基因的酶学特性及自交不亲和基因分子机理研究提供理论参考。

关键词：扁桃；S-基因；多态性；生物信息学分析

0引 言

【研究意义】扁桃(AmygdaluscommunisL．)，又名巴旦杏，属于蔷薇科(Rosaceae)李亚科桃属扁亚属落叶乔木，为世界著名干果及木本油料树种。新疆南部具有扁桃生长发育的气候条件和资源优势，是我国扁桃的主产区[1]。自交不亲和性是高等植物在进化过程中为保持遗传变异特性逐渐形成的一种重要机制，而扁桃普遍具有配子体自交不亲和性，品种间S基因型的差异性导致授粉亲和力不稳定、结实率低，生产上需合理配置授粉树以提高产量[2]。因此，扁桃S-基因的研究，对栽培生产、遗传改良具有重要的理论意义和实践价值。【前人研究进展】依据控制因子不同，自交不亲和类型分为孢子体自交不亲和(Sporophytie self-incompatibility, SSI)和配子体自交不亲和类型(Gametophytic self-incompatibility,GSI)[3]。苹果、扁桃、梨等蔷薇科果树通常属于配子体型自交不亲和性植物[4]，该类型是由复等位基因的单一位点即S-基因决定。GSI花粉管常常在花柱传递组织，特别是花柱中上部1/3处停止生长，这些表型由花粉本身的单倍体基因所决定[5]。基于S基因型不相同的品种之间授粉亲和力强、结实性高的原理，运用科学鉴定的S-基因型来确定合理的授粉树品种是科学高效的方法，因此研究自交不亲和性果树的S-基因对栽培中品种搭配和遗传育种具有重要的指导意义[6-7]。【本研究切入点】利用生物信息学技术对目的基因进行序列分析，是初步确定基因结构及预测其生物学功能的有效方法，对新疆喀什当地品种进行S-基因多态性与生物信息学分析还鲜见报道。【拟解决的关键问题】研究采用生物信息学分析方法，对8个新疆扁桃S-基因理化性质、结构特征和功能域等进行分析，揭示该物种S-基因的结构，并对其生物学功能进行预测分析，为新疆扁桃分子生物学研究及自交亲和性育种奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材 料

以本课题前期克隆得到的8个新疆扁桃品种的S-基因序列为基础，结合从Genbank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载樱桃、欧洲李、矮扁桃等植物的S-基因序列进行序列分析。表1

1.2方 法

对8个克隆、测序比对正确的扁桃S-基因序列及其编码蛋白采用表1中所列软件进行生物信息学分析，对其结构、理化特性和生物学功能进行分析和预测。

表1　生物信息学分析软件信息

2结果与分析

2.1扁桃S-基因序列理化性质

用Prot Param在线工具分析8个新疆扁桃品种S-基因的核苷酸及其氨基酸序列。研究表明，氨基酸序列长度在198～257 aa，分子量在23 412.9～30 720.8 Da，理论等电点在8.62～10.30，均为不稳定性蛋白。亚细胞定位分析表明除了白薄壳S蛋白在细胞膜上，其余主要定位在质膜上。利用SMART分析S蛋白的功能域，表明S蛋白均具有一个RNase-T2功能域，属于RNase蛋白家族。

对S蛋白的亲水性/疏水性分析显示，亲水区域显著大于疏水区域，说明S蛋白是亲水性蛋白，其亲水性较强。该蛋白均存在1～3个跨膜区，属于跨膜蛋白，均不存在信号肽，不是分泌性蛋白。蛋白磷酸化位点分析表明，多数S蛋白具有1～4个丝氨酸位点，其中双薄、叶尔羌、白长巴旦S蛋白不具有相对保守的丝氨酸位点。表2

2.2S蛋白同源性比较

利用DNAman对8个新疆扁桃S-基因氨基酸序列进行同源性比对。研究表明，叶尔羌和双软同源性最高，达到99.5%，苦巴旦和黄双的同源性为99.2%，白长巴旦与叶尔羌的同源性高达99%，白长巴旦与双软的同源性高达98.5%；双软和黄双，白长巴旦和黄双，白长巴旦和苦巴旦的同源性较低，仅为21.3%。其余品种之间同源性也比较集中，一部分在23%～31%，另一小部分为63%左右。说明同源性之间有高度相似的部分，但差异也是显著的。观察图形化的多重序列比对结果，证实了上述同源性比对的结果。通过Weblogo图可以看出，不同品种扁桃的S蛋白具有保守结构域YFQFVQQWPPT。图2，图3，表3

表2　8个新疆扁桃品种的S蛋白理化性质

图1　黄双扁桃S-基因序列理化性质

品种黄双Huangshuang双薄Shuangbo双软Shuangruan白薄壳Baiboke叶尔羌Yeerqiang苦巴旦Kubadan阿曼尼莎Amannisha白长巴旦Baichangbadan黄双Huangshuang100双薄Shuangbo63.4100双软Shuangruan21.323.7100白薄壳Baiboke25.531.024.1100叶尔羌Yeerqiang21.323.799.524.1100苦巴旦Kubadan99.263.821.325.423.7100阿曼尼莎Amannisha25.431.023.764.523.725.4100白长巴旦Baichangba-dan21.323.798.524.699.021.323.7100

图2　8种扁桃推导S氨基酸序列比对

图3　8种扁桃S氨基酸序列Logo图谱

2.3S蛋白系统进化树

用ClustalX1.83和MEGA6.0.5软件对上述18种植物的S氨基酸序列构建系统进化树，采用默认参数，自检举1 000次，对生成的系统树进行Bootstrap校正。研究表明，在同一个进化分支上，18个物种分为三大类，新疆本土扁桃S基因分为两个类群。其中，阿曼尼沙、白薄壳、双软、黄双、苦巴旦在一枝。白长巴旦、双薄和叶尔羌在另一枝，与巴旦杏距离较近。剩余的物种为一类，这与同源性比较的结果相一致。图4

2.4S蛋白二级结构

通过NPS程序对8种扁桃S蛋白序列进行二级结构分析表明，S蛋白均由α螺旋、β折叠、无规则卷曲和延伸链等结构元件组成，其中无规则卷曲所占比例最高，在39.6%～51.75%，其次为α螺旋或延伸链，β折叠所占比例最小。在不同扁桃品种的S蛋白中，4种结构元件的百分比和分布均不同，这可能与不同品种中的S蛋白所具有的具体生物学功能不同有关。表4

图4　18种植物S蛋白的系统进化

植物种类PlantSpecies二级结构元件比例Theproportionofsecondarystructureelements(%)α螺旋Alphahelix延伸链Extendedstrand无规则卷曲Randomcoil二级结构元件分布Secondarystructureelementsdistribution黄双Huanghuang30.3525.6843.97双薄Shuangbo40.9112.1246.97双软Shuangruan24.7123.5351.76白薄壳Baiboke34.5115.0450.44叶尔羌Yerqiang40.4012.6346.97苦巴旦Kubadan33.8522.5743.58阿曼尼莎Amannisha47.612.839.6白长巴旦Baichangbadan37.3712.6350

2.5S蛋白三级结构分析

利用Swiss-Model采用同源建模的方法预测不同扁桃品种S蛋白的三级结构。S蛋白三级结构主要是由α螺旋、延伸链和无规则卷曲等二级结构元件构成，不同扁桃品种的S蛋白三级空间结构相似度高，保守性强。图5

A.阿曼尼沙；B.双软；C.黄双；D.白长巴旦

3讨 论

S-RNase是一种S糖蛋白，具有核酸酶活性，又称为S-核酸酶，其氨基酸同源性为38%～98%，其不同S-单倍型核酸酶具有高度多态性，而高变区的多态性为不同S-RNase的鉴定依据[8]。对樱桃[9]、苹果[10]梨[11]和杏等[12]果树S-RNase的编码cDNA序列进行对比分析发现，果树S-RNase基因的结构特征存在极高的相似性。研究通过课题RT-PCR获得了8个新疆扁桃S-基因的cDNA序列，对该基因编码的蛋白氨基酸序列进行分析，所获得cDNA序列编码合成的S-基因氨基酸序列包含氨基酸数目在198～257 aa，自成两个类群，白长巴旦，双薄、叶尔羌为一个类群，黄双、双薄、双软、白薄壳、苦巴旦、阿曼尼莎为另一个类群。

对8个新疆扁桃S-基因进行一系列生物信息学分析表明，S-基因均具有一个典型的RNase-T2功能域，属于RNase蛋白家族[13]。序列比对发现扁桃S-基因与其他植物物种的S-基因家族具有极高的相似性，其中该类蛋白的N端保守结构区域相似性极高，而其C端的质体信号肽序列区差异性则较大，这表明不同品种扁桃间S蛋白功能的差异性可能通过其特异的C端序列发挥作用。

4结 论

S氨基酸序列理化性质分析显示，这8个S-基因理论等电点pI在8.62～10.30，脂肪指数基本上比较凌乱，最小的65.09，最大的86.31，均为较不稳定蛋白，均富含丝氨酸；系统进化分为2枝，黄双、双薄、双软、白薄壳、苦巴旦、阿曼尼莎聚在一分枝上，其他的聚在另一分枝上；均不存在信号肽，不是分泌性蛋白，均存在1～3个跨膜区，属于跨膜蛋白，定位在在细胞膜上；S氨基酸序列的二级结构中，α-螺旋和无规则卷曲是S多肽链中的大量结构元件；整个肽链中，呈无规则卷曲>α-螺旋>延伸链>β-转角的规律，其中无规则卷曲占主导地位。

参考文献(References)

[1]李疆，曾斌，罗淑萍，等．中国野扁桃资源的保护及引种繁育[J]．新疆农业学，2006，43(1)：61-62．

LI Jiang，ZENG Bin，LUO Shu-ping，et al．(2006)．Protection and Propagation of Amygdalus Ledebouriana Schleche in China [J].XinjiangAgriculturalSciences，43(1)：61-62．(in Chinese)

[2]吕志江，李疆，吾买尔夏提·塔汉，等．新疆野扁桃种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]．果树学报，2010，27(6)：918-923．

LV Zhi-jiang，LI Jiang，Wumaierxiati Tahan，LUO Shu-ping，et al．(2010)．ISSR analysis for genetic diversity of Amygdalus ledebouriana germplasm from Xinjiang，China [J].JournalofFruitScience，27(6)：918-923．(in Chinese)

[3] Ken-ichi, Kubo, Tetsuyuki, Entani, Akie, Takara, Ning, Wang, Allison M, Fields, & Zhihua, Hua. (2010). Collaborative non-self recognition system in s-rnase-based self-incompatibility.Science, 330(6005):796-799.

[4] Ivanov, R., Fobis-Loisy, I., & Gaude, T. (2010). When no means no: guide to brassicaceae self-incompatibility.TrendsinPlantScience, 15(7):387-394.

[5] Scalone, R., & Albach, D. (2014). Cytological evidence for gametophytic self-incompatibility in the genus veronica.TurkishJournalofBotany, 38(1):197-201.

[6] Certal, A. C., Sanchez, A. M., Kokko, H., Broothaerts, W., Oliveira, M. M., & Feijó, J. A. (1999). S-rnases in apple are expressed in the pistil along the pollen tube growth path.SexualPlantReproduction, 12(2):94-98.

[7]郭长奎，李疆，罗淑萍，等．扁桃花粉SFB 基因的鉴定和序列分析[J]．经济林研究，2009，27(6)：18-23．

GUO Chang-kui，LI Jiang，LUO Shu-ping，et al．(2009)．Identification and Sequence Analysis of Pollen SFB Gene in Almond [J].NonwoodForestResearch，27(6)：18-23．(in Chinese)

[8] Meng, D., Gu, Z., Wang, A., Yuan, H., Li, W., & Yang, Q., et al. (2014). Screening and characterization of apple rho-like gtpase (mdrops) genes related to s-rnase mediated self-incompatibility.PlantCellTissue&OrganCulture, 117(3):465-476.

[9]李晓，张绍铃，吴俊，等．樱桃品种S基因型及自交不亲和性分子机制研究进展[J]．生物技术通报，2006,(6)：28-33．

LI Xiao，ZHANG Shao-ling，WU Jun，et al．(2006)．Studies on S Genotypes and Molecular Mechanism of self-incompatibility in Cherry[J]．BiotechnologyBulletin,(6)：28-33．(in Chinese)

[10] Dong, M., Zhaoyu, G., Wei, L., Aide, W., Hui, Y., & Qing, Y., et al. (2014). Apple mdabcf assists in the transportation of s-rnase into pollen tubes.PlantJournal, 78(6):990-1,002.

[11]乌云塔娜，谭晓风，李秀根，等．梨自交不亲和新基因S12-RNase的分离鉴定及序列分析[J]．林业科学，2006，42(4)：117-121．

WU Yun-tana，TAN Xiao-feng，LI Xiu-geng，et al．(2006)．Isolation and Identification of S12-RNase Gene of Pyrus bretschneideri[J]．ScientiaSilvaeSinicae，42(4)：117-121．(in Chinese)

[12] Zhang, L., Chen, X., Chen, X., Zhang, C., Liu, X., & Ci, Z., et al. (2008). Identification of self-incompatibility ( s- ) genotypes of chinese apricot cultivars.Euphytica, 160(2):241-248.

[13] Collani, S., Alagna, F., Caceres, E. M., Galla, G., Ramina, A., & Baldoni, G., et al. (2012). Self-incompatibility in olive: a new hypothesis on the s-locus genes controlling pollen-pistil interaction.ActaHorticulture, 967(1):133-140.

Fund project:Supported by the Basic Science and Technology Research Support Funds of Non-profit Research Institutions of Xinjiang Uygur Autonomous Region "germplasm identification of S-genotypes based on local almond in Xinjiang."(KY2015072); NSFC "Studies on the relationship between physiological fruit drop and sucrose metabolism in "Zhipi" almond of Xinjiang"

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.06.013

收稿日期(Received)：2016-02-06

基金项目:自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目“基于S-基因型鉴定的新疆本地扁桃种质资源鉴定(KY2015072)”；国家自然科学基金项目“新疆‘纸皮’扁桃幼果生理脱落与蔗糖代谢关系的生理与分子机制研究”

作者简介:郭春苗(1982-)，女，助理研究员，硕士，研究方向为新疆特色果树生物技术改良，(E-mail)chunmiaoguo@126.com 通讯作者(Cotresponding author):王继勋(1965-)，男，研究员，研究方向为果树资源收集与种质创新，(E-mail)ee_wjx@163.com

中图分类号：S662.9

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)06-1067-07

Studies on Polymorphism and Bioinformatics of 8 Xinjiang Almonds Self-incompatibility Gene (S-gene)

GUO Chun-miao1, YANG Bo1, Tudi Maimaiti2, LI Ning1, TANG Ya-ping1,GONG Peng1, WANG Ji-xun1

(1ResearchInstituteofHorticulturalCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences/XinjiangFruitScienceExperimentStation,MinistryofAgriculture,Urumqi830091,China；2.ShacheCountyForestryBureau,ShacheXinjiang844700,China)

Abstract：【Objective】 Self incompatibility gene (S-gene) is an important candidate gene affecting reproductive traits of almond. It has important significance in the selection of self compatible varieties of fruit tree and the selection of pollination tree. This paper is preliminary studies on S-gene sequence, gene structure, gene polymorphism of 8 Xinjiang almond.【Method】This experiment used the Blast, Protparam and Signalp bioinformatics software to analyze the physical and chemical properties, polymorphism, phylogenetic tree and protein structure of 8 Xinjiang almond S-gene.【Result】The S amino acid of Xinjiang almond contained signal peptide and had a membrane structure, but it wasn't a secretory protein. It has been assumed that S amino acid may be located in the cell membrane to play a function. Through phylogenetic tree analysis，they were divided into two groups；The secondary structure was composed of irregular coil, alpha helix, extended chain, etc.【Conclusion】The analysis results of S-gene sequence, gene structure, gene polymorphism of 8 Xinjiang almond will provide a theoretical reference for the enzymatic properties of S- gene and the molecular mechanism of self incompatibility gene.

Key words:almond；self-incompatibility gene；polymorphism；bioinformatics analysis