实时荧光PCR法快速检测地中海实蝇的研究

李京，张祥林，罗明，李亚伟，王翀中， 张小菊

(1新疆农业大学农学院，乌鲁木齐　830052；2新疆出入境检验检疫局，乌鲁木齐　830063)



实时荧光PCR法快速检测地中海实蝇的研究

李京1,2，张祥林2，罗明1，李亚伟2，王翀中2， 张小菊2

(1新疆农业大学农学院，乌鲁木齐830052；2新疆出入境检验检疫局，乌鲁木齐830063)

摘要：【目的】设计用于扩增地中海实蝇的特异性引物，建立快速、灵敏检测地中海实蝇的实时荧光PCR方法。【方法】采用实蝇科昆虫线粒体DNA COI基因的通用引物扩增地中海实蝇以及其它三种供试实蝇的DNA片段，经测序、比对分析，设计出扩增地中海实蝇的特异性引物，用SYBR Green 实时荧光PCR方法验证该引物的特异性与灵敏度。【结果】设计的引物对DZH-F/DZH-R能特异性检测出地中海实蝇，扩增产物的溶解曲线峰值Tm为79.2。该对引物检测地中海实蝇的灵敏度为10-3ng/μL。【结论】所建立的SYBR Green 实时荧光PCR方法检测地中海实蝇特异性强、灵敏度高。

关键词：地中海实蝇；COI基因；实时荧光PCR；快速检测

0引 言

【研究意义】实蝇科(Tephritidae)是双翅目(Diptera)昆虫中的重要类群，全球有40余种实蝇是为害农作物的检疫性害虫，其中果实蝇属(Ceratitis)是最具经济重要性的实蝇类群[1]。许多实蝇种类对多种果实造成巨大危害，如橘小实蝇 (B.dorsalis)能够危害芒果、番石榴、杨桃等250余种水果，果实受虫害后，可造成落果或果实失去经济价值；瓜实蝇(B.cucurbitae)对果蔬的危害范围也达到80余种，并且主要对葫芦科植物危害较严重；枣实蝇(C.vesuviana)虽然寄主较为单一，但其对枣果危害十分严重，该虫2007年在我国新疆地区首次发现，对当地枣产业造成了巨大的经济损失。地中海实蝇(C.capitata)是世界性果蔬害虫，在全世界 80 多个国家和地区有分布，由于地中海实蝇经济意义十分巨大，被各国公认为“果蔬头号杀手”[2-5]。1929年，美国佛罗里达州首次发现了地中海实蝇，此次造成了700多万美元的经济损失，此后在该州陆续发生了多次，所造成的经济损失难以估计[6]。近年来，新疆检验检疫局在新疆多个地区分别监测到枣实蝇、瓜实蝇和橘小实蝇，但尚未发现地中海实蝇传入我区。随着丝绸之路经济带核心区的建设与发展，新疆同周边国家的农产品贸易量逐年增加，地中海实蝇的传入风险也相对增加，同时由于地中海实蝇具有寄主多且繁殖能力超强的特点，其在新疆的传播概率也因此相对增大。新疆是我国的水果、蔬菜种植大省，一旦地中海实蝇传入造成的经济损失将难以估计。因此研究建立能够快速检测出地中海实蝇的分子生物学方法意义重大。【前人进展】吴佳教等[7](2005)从实蝇线粒体DNA(mtDNA)COII基因序列中筛选出特异性引物，并用PCR-RFLP法和限制性内切酶MSEI、DRAI成功将9种检疫性实蝇区分开[6]；朱振华等[8](2005)研究表明mtDNA Cytb基因也可以作为鉴别实蝇的方法[7]；余道坚[9](2005)应用SS-PCR、TaqMan MGB探针实时荧光PCR等方法将10种检疫性实蝇(地中海实蝇、桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、木瓜实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇、杨桃实蝇、辣椒实蝇)区分开；程晓甜等[10](2013)对于线粒体DNA(mtDNA)COI基因，采用SS-PCR、SYBR Green实时荧光PCR等方法从设计的一对引物中筛选出检测枣实蝇的特异性引物，成功将枣实蝇与其他5种实蝇区分开(桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇)[10]；姜帆等[11](2015)用SS-PCR、TaqMan MGB探针实时荧光PCR方法对27种检疫性实蝇线粒体DNA(mtDNA)COI基因的比对设计出了27对特异性引物并筛选出TaqMan MGB探针，成功将27种实蝇一一区分开。【本研究切入点】由于mtDNA被看作检测物种进化的较为重要的分子标记方法[12-13]，因此研究以四种实蝇的DNA为模板、运用COI引物扩增出目的片段，经测序后运用生物信息学分析四种实蝇COI序列，设计出一对特异性引物，用SYBR Green实时荧光PCR方法特异性检测地中海实蝇。【拟解决的关键问题】指导口岸检验检疫局从口岸疫情截获或在出口注册果园监测点，诱捕到的实蝇样品中快速检测，并确定有无地中海实蝇。

1材料与方法

1.1 材 料

地中海实蝇成虫样品由广东出入境检验检疫局和中国检验检疫科学研究院提供，橘小实蝇、瓜实蝇和枣实蝇的成虫样品来源于新疆出入境检验检疫局近几年在当地诱捕到的样品。供试实蝇标本均用100%酒精浸泡。表1

1.2方 法

1.2.1基因组DNA提取

无菌操作条件下，用磁珠法基因组提取试剂盒(天根DP329)提取供试实蝇样品DNA，-20℃保存备用。

表1　供试实蝇及来源

1.2.2目的片段DNA扩增

用mtDNA COI基因通用引物COI-F/ COI-R扩增4种供试实蝇，该引物序列为：COI-F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，COI-R：5'-TAAACT TCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ 。PCR反应体系：DNA模板1 μL，2×Mix预混液12.5 μL，上游引物COI-F 0.5 μL，下游引物COI-R 0.5 μL，加水至25 μL。PCR反应程序：94℃/3 min；94℃/30s，53℃/30s，72℃/1 min，共36 个循环；最后 72℃延伸 7 min。取 PCR 产物 5 μL在1.5%琼脂糖凝胶上电泳 30 min(90V)，置于凝胶成像分析系统进行观察照相，取20 μL PCR产物送生物技术公司测序。

1.2.3设计特异性引物

用DNAMAN8.0及GENEDOC法将该实验测序得到的地中海实蝇的mtDNA COI基因序列(已在Genbank获得序列号：KU096056)为靶序列，与本实验测序得到的桔小实蝇(已获得Genbank序列号：KU131575)、瓜实蝇(已获得Genbank 序列号：KU096057)和枣实蝇(已获得Genbank 序列号：KU131576)，以及在Genbank中下载的南瓜实蝇Bactroceratau(序列号：AY398753)、油榄实蝇Bactroceraoleae(序列号：AY210702)、辣椒实蝇Bactroceralatifrons(序列号：AF423103)等COI基因序列进行比对分析。根据分析结果，采用Primer Permier 5.0软件设计检测地中海实蝇的特异性引物对DZH-F/DZH-R，送至生物技术公司合成。

1.2.4SYBR Green 实时荧光PCR检测

1.2.4.1DZH-F/DZH-R引物的特异性验证

用实时荧光PCR仪(ABI QuantStudioTM7 Flex Real-Time PCR system)进行SYBR Green PCR扩增。反应条件：SYBRPremixExTaqTM(2×)10 μL，上下游引物(10 μM)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，dH2O补至20 μL。反应程序：第一步：95℃/30s；第二步(扩增曲线)：95℃/5s，60℃/30s,共40个循环；第三步(溶解曲线)：95℃/15s，60℃/1 min，95℃/15s。用桔小实蝇、瓜实蝇、枣实蝇来验证引物DZH-F/DZH-R的特异性。

1.2.4.2引物DZH-F/DZH-R的灵敏度检测

将模板的DNA进行倍比稀释，共设置7个浓度梯度，分别为：20、10、1、10-1、10-2、10-3和、10-4ng/μL，用以检测该引物的灵敏度，PCR反应条件及反应程序同上。

2结果与分析

2.1通用引物COI-F/ COI-R扩增结果

用通用引物COI-F/ COI-R扩增供试地中海实蝇、桔小实蝇、瓜实蝇和枣实蝇，扩增产物电泳结果表明：4种实蝇均有泳带，大小均为670 bp。图1

2.2引物DZH-F/DZH-R特异性验证结果

用所设计的特异性引物DZH-F/DZH-R对4种供试实蝇进行SYBR Green 实时荧光PCR扩增，结果表明，仅地中海实蝇有扩增曲线，其Ct值为15.2，其它3种实蝇未出现扩增曲线。图2

实时荧光PCR扩增产物的溶解曲线结果显示，4种供试实蝇中仅地中海实蝇有产物峰出现，其Tm=79.2。图3

M:DL2000 Marker；1～2：地中海实蝇；3：桔小实蝇；4：瓜实蝇；5：枣实蝇；6：空白

2.3引物DZH-F/DZH-R灵敏度检测结果

将提取的地中海实蝇DNA倍比稀释成7个浓度梯度：20、10、1、10-1、10-2、10-3和L、10-4ng/μL，进行SYBR Green 实时荧光PCR扩增。结果显示，当地中海实蝇DNA浓度为10-3ng/μL 时，该引物仍能检测到(Ct>35时，其扩增视为阴性)，不同浓度的DNA平均Ct值分别是：18.8(20 ng/μL)、22.7(10 ng/μL)、26.2(1 ng/μL)、29.4(10-1ng/μL)、32.6(10-2ng/μL)、35.0(10-3ng/μL)、38.2(10-4ng/μL)。图4

此外，不同浓度的DNA所扩增产物的溶解曲线峰值相同(Tm=79.2)。图5

1～2: 地中海实蝇的扩增曲线；3～5: 其它实蝇的扩增曲线

1: 地中海实蝇的PCR产物溶解曲线；2～4: 其它实蝇的PCR产物溶解曲线

A-G：不同浓度的地中海实蝇DNA实时荧光PCR扩增曲线，A:20 ng/μL; B:10 ng/μL; C:1 ng/μL; D:10-1 ng/μL;

A-C：不同浓度的地中海实蝇模板DNA SYBR Green 实时荧光PCR产物溶解曲线；D：空白对照

3讨 论

由于新疆截获橘小实蝇、瓜实蝇、枣实蝇的频率较高，因此研究用该三种实蝇检测设计的地中海实蝇的引物的特异性。尽管余道坚[9]2005年建立了地中海实蝇快速鉴定方法，但该方法设计的引物并不能证明扩增不出几种常见的检疫性实蝇，如：橘小实蝇、瓜实蝇、枣实蝇。针对四种常见的检疫性实蝇(地中海实蝇、橘小实蝇、瓜实蝇、枣实蝇)设计出特异性检测地中海实蝇的引物。同时，相对于2015年姜帆等[11]建立的用SS-PCR、TaqMan MGB探针实时荧光PCR方法检测27种检疫性实蝇线粒体DNA(mtDNA)COI基因的方法，此项研究依然具有一些优势：对于建立的SS-PCR技术，该技术的灵敏度更高，更具有可信度；相对于建立的TaqMan MGB探针技术该项技术更为经济，更为适用于大量的实蝇检测。但相对于前两项的研究，设置的对照组较少。

用SYBR Green 实时荧光PCR方法验证引物特异性时，虽然PCR产物的溶解曲线除地中海实蝇外其他两种实蝇出现了微弱的峰，但SYBR Green 实时荧光PCR扩增仅地中海实蝇有扩增曲线出现，因此认为该引物能特异性鉴定地中海实蝇。在验证引物的灵敏度实验中，当地中海实蝇浓度为10-4ng/μL时，其扩增曲线的Ct值为38.2，有相关文献表示当扩增曲线的Ct值大于35时可认为该样品或该浓度不被扩增[14]，因此认为引物DZH-F/DZH-R扩增为阴性即检测不到10-4ng/μL浓度的地中海实蝇。

4结 论

研究比对、分析地中海实蝇、橘小实蝇、瓜实蝇、枣实蝇四种常见的检疫性实蝇的线粒体COI基因序列，建立了一种特异性鉴定地中海实蝇的SYBR Green 实时荧光PCR方法，成功将地中海实蝇与其他三种实蝇区分开，该方法为后人的相关研究提供了可靠的依据与参考。

近年来，新疆地区已经有橘小实蝇实蝇、瓜实蝇、枣实蝇的相关报道，但地中海实蝇还未发现。但随着新疆与周边的中亚地区的国家贸易的频繁，比如，从哈萨克斯坦进口芒果，在当地芒果中已经发现了地中海实蝇，建立地中海实蝇快速检测方法，为口岸检疫性害虫的监测与预防提供了技术支持。

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Fund project:Supported by Public welfare industry scientific research project of General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (201310091); Xinjiang Agriculture University research joint graduate training program (xjaucxy-yjs-20131023)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.06.018

收稿日期(Received)：2016-01-14

基金项目:国家质检公益性行业科研项目(201310091)；新疆农业大学产学研联合培养研究生项目(xjaucxy-yjs-20131023)

作者简介:李京(1990-)，女，山东人，硕士研究生，研究方向为植物检疫病害，(E-mail)13579981032@163.com 通讯作者(Cotresponding author):张祥林(1964-)，男，新疆人，研究员，研究方向为分子植物病理学，(E-mail)XL6479@163.com

中图分类号：S412

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)06-1107-07

Study on Rapid Detection Method of Mediterranean Fruit Fly by Real-Time PCR Assay

LI Jing1,2，ZHANG Xiang-lin2，LUO Ming1，WANG Chong2，LI Ya-wei2，ZHANG Xiao-ju2

(1.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China2.XinjiangEntryandExitInspectionandQuarantineBureau,Urumqi830063,China)

Abstract：【Objective】 Fruit flies (Tephritidae) described all over the world are more than 450 insect species and 4，300 kinds, there were more than 70 kinds including the Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitate) in Xinjiang, which endanger agriculture greatly. It is of significance in plant quarantine to set up quarantine fruit fly, especially immature worm state fast and reliable identification method.【Method】Using the fruit flies general primer amplification of mitochondrial DNA COI gene to amplify targeted fragments, sequence, blast, then design specific primers which verified its specificity and sensitivity using SYBR Green real-time PCR.【Result】The primers DZH-F/DZH-R could specific amplify ceratitis capitate. The production peaks was 79.2. This primer could detect 10-3ng/μL of ceratitis capitate template DNA.【Conclusion】A assay of SYBR green real-time PCR has been established to detect the Mediterranean fruit fly, which has strong specificity and high sensitivity.

Key words:Mediterranean fruit fly; mtDNA; SYBR Green real-time PCR; rapid detection