解淀粉芽孢杆菌B15产脂肽的分离鉴定及抑菌机理

朱弘元++康健++范昕

摘要：从葡萄表皮分离获得1株对霉菌具有明显抑制作用的解淀粉芽孢杆菌B15，对其发酵液经过酸沉、Sephadex LH-20层析柱，对抑菌脂肽的特性进行研究。结果发现，该菌株产脂肽对葡萄灰霉病菌有较好的抑制效果，60～100 ℃ 处理或pH 值为2～10的脂肽对灰霉病菌的抑菌活性几乎没有影响；脂肽有效最低抑菌浓度为0.017 mg/mL。经高效液相色谱法（HPLC）和质谱分析发现，解淀粉芽孢杆菌B15产脂肽主要活性成分为iturin A、fengycin。

关键词：脂肽；解淀粉芽孢杆菌；分离纯化；抑菌机理；鉴定

中图分类号： TS201.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0186-04

1945年，Johnson等报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质[1]。1968年，Arima等首次发现枯草芽抱杆菌能够产生抗菌脂肽surfactin[2]。除枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）外，解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B. lichemformis）、环状芽孢杆菌（B. circulan）、蜡样芽胞杆菌（B. cereus）和短小芽孢杆菌（B. pumilus）等[3-9]都能产生抗菌脂肽。近年来，不断有新的脂肽被发现。

脂肽应用广泛。天然脂肽提取物可以直接用于提高原油采收率、治理环境如生物修复、生物降解、生物除污等[10-12]，这是目前全球关注的热点；60%～80%纯度的脂肽能作为微型乳剂，用于日用和食品工业如洗衣液、奶粉等[13-16]，更纯的脂肽可用于保健品和药品等[17-19]。目前，通过基因工程提高了生产菌种的性能，优化培养条件有效提高了脂肽的产量，但由于脂肽分子量比较接近（iturin分子量为1 043～1 112 u，surfactin分子量为994～1 064 u，fengycin分子量为1 435～1 580 u）、结构比较复杂、脂肽分子具有聚合现象[20]等，脂肽的分离纯化具有一定难度，有待进一步探索。细菌B15是中国食品发酵工业研究院酿酒部从葡萄表皮上分离得到1株对霉菌具有明显抑制作用的菌株，经鉴定为产脂肽的解淀粉芽孢杆菌。本试验对其产出的脂肽进行分离纯化鉴定，对其抑菌机理进行初步研究，为解淀粉芽孢杆菌B15产脂肽的开发利用奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料和设备

1.1.1菌株解淀粉芽孢杆菌B15、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由中国食品发酵工业研究院酿酒部提供；葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea），由中国科学院植物保护所提供。

1.1.2培养基称取38 g PDA培养基，溶解到1 000 mL水中，121 ℃灭菌15 min。Landy培养基配制：葡萄糖30 g、L-谷氨酸钠14.0 g、MgSO4 0.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO4 1.0 g、FeSO4 0.15 mg、MnSO4 5.0 mg、CuSO4 0.16 mg，溶解到1 000 mL水中，2 mol/L HCl调节pH值为7.2，115 ℃灭菌15 min。

1.1.3主要仪器和设备美国产Agilent 1260 Infinity型高效液相色谱仪、高效液相色谱串联质谱仪（Water Acquity UPLC-MS/MS）；奥林巴斯荧光显微镜BX51；上海沪西产蛋白层析仪。制备型液相色谱，北京慧德易科技有限责任公司生产；冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂生产；冷冻离心机，北京雷勃尔离心机有限公司生产；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂生产；氮吹仪，天津恒奥科技发展有限公司生产。

1.2试验方法

1.2.1分离和纯化

1.2.1.1发酵液的粗分离将B15菌种从种子培养基按4%接种量接种到Landy培养基中，30 ℃ 180 r/min培养 48 h，得到含抑菌组分的发酵液；将发酵液 4 ℃ 10 000 r/min离心30 min，收集上清液；用 6 mol/L HCl 调节pH值至 2.0，边加 HCl 边轻微搅拌；4 ℃保藏8 h或过夜；4 ℃ 10 000 r/min离心30 min，弃去上清；用少量无菌水冲洗沉淀，用NaOH调节pH值至7.0，冷冻干燥。

1.2.1.2抑菌脂肽的纯化将冻干样品以1 ∶10溶解在甲醇中，30 ℃ 120 r/min摇床振摇30 min，过0.22 μm滤膜；吸取2 mL样品过Sephadex LH-20柱，使用甲醇作洗脱剂，流速为0.3 mL/min，吸光度为210 nm；收集洗脱峰，氮吹浓缩，备用。

1.2.2脂肽特性研究

1.2.2.1抑菌活性测定将PDA培养基灭菌，置于50～55 ℃ 水浴锅中保持；吸取100 μL浓度为100万CFU/mL的葡萄灰霉孢子加入PDA培养基，摇晃均匀；倒平板，待凝固时，将无菌的牛津杯放在培养基上轻轻挤压，使之无缝隙；在牛津杯中加入150 μL纯化脂肽，以甲醇作空白，25 ℃培养 7 d，测定其抑菌圈直径。

1.2.2.2最小抑菌浓度测定将有抑菌活性的洗脱峰溶解在甲醇中，稀释成不同浓度的溶液，以未处理样品作为对照，测定其抑菌活性。

1.2.2.3温度对抑菌活性的影响吸取1 mL脂肽溶液，分别于60、80、100 ℃水浴锅中水浴30 min、60 min、2 h；另吸取脂肽溶液1 mL，121 ℃处理20 min，冷却至室温；以未处理样品作为对照，分别测定其抑菌活性。

1.2.2.4pH值对抑菌活性的影响吸取1 mL脂肽溶液，分别用6 mol/L HCl、NaOH调节pH值为2～12，保持2 h，调回初始pH值6.0，以未处理脂肽溶液作为对照，测定其抑菌活性。

1.2.2.5脂肽对真菌菌丝体的影响取对数生长期葡萄灰霉孢子100万CFU/mL，接种到高压灭菌、盖有22 mm×22 mm 盖玻片的6孔培养板中培养24 h；加入终浓度为 0.3 mg/mL 的脂肽培养4 h，用PBS缓冲液漂洗3次；在待镜检菌丝中各加入1滴Calcofluor White、10%NaOH氢氧化钠染色1 min，置于荧光显微镜下观察。

1.2.3脂肽的鉴定选取有抑菌效果的洗脱峰样品进入制备型液相色谱分析，色谱柱为Maisch，规格为 C18、250 mm×10 mm、5 μm、180 A，使用乙腈和水进行梯度洗提，收集各组分，浓缩；进行抑菌试验，收集有抑菌效果的组分，用高效液相色谱串联质谱仪进行鉴定。

2结果与分析

2.1抑菌脂肽的分离纯化

经酸沉淀得到的粗提液呈黄褐色。由图1可见，粗提液经滤膜滤菌、过Sephadex LH-20层析柱，所得层析图中共有3个峰。经活性检测，peak 1具有抑制真菌活性（图2）。

2.2抑菌脂肽的特性研究

2.2.1不同脂肽浓度的抑菌效果试验结果表明，抗菌脂肽浓度不同，对葡萄灰霉病菌的抑菌效果有较大差异，脂肽浓度大于0.5 mg/mL时有较好的抑菌效果，抑菌圈直径大于20 mm（图3）；浓度小于0.5 mg/mL时，随脂肽浓度的降低，抑菌效果下降很快，当脂肽浓度小于0.017 mg/mL时，脂肽没有抑菌作用。因此，解淀粉芽孢杆菌B15产脂肽最小的抑菌浓度（MIC）是0.017 mg/mL。

2.2.2不同温度和pH值处理的脂肽对灰霉病菌的抑菌效果由图4、图5可见，温度处理的脂肽对灰霉病菌的抑制作用相差不大，几乎没有影响；pH 值为2～10时处理的脂肽有较好的抑菌活性，pH值大于12时，脂肽的抑菌活性有较大损失。

2.2.3抑菌脂肽对灰菌病菌菌丝体的影响由图6可见，正常的葡萄灰霉病菌菌丝体均匀细长，而脂肽处理的葡萄灰霉病菌菌丝体膨胀，数量减少，并且顶端出现明显膨大。

2.3脂肽的鉴定

由图7、图8、表1可见，具有抑菌活性的脂肽peak1进入制备型液相色谱共收得6个组分，其中1-1、1-2、2组分的m/z分别是1 058、1 058、1 072，对灰霉病菌和酵母具有较好的抑菌效果，推测可能是iturin A，使用高效液相色谱法[21]对1-1、1-2、2组分与Sigma公司的标品进行对比，确定1-1、1-2、2组分分别是2种结构的C15 iturin A、C16 iturin A；3、4、5组分的m/z在1 400～1 600之间，为fengycin类物质，m/z为1 449、1 464可能是C15、C16 fengycin A或C13、C14 fengycin B，m/z为1 477、1 492可能是C17、C18 fengycin A或 C15、C16 fengycin B。

表1抑菌组分的鉴定和性质

组分保留时间

（min）峰分离度抑制菌株种类可能物质1-133.2760.93葡萄灰霉、酵母C15 iturin A1-233.4991.90葡萄灰霉、酵母C15 iturin A235.4781.25葡萄灰霉、酵母C16 iturin A339.0～45.5葡萄灰霉C15、C16 fengycin A；C13、C14 fengycin B446.2841.81葡萄灰霉C15-19 fengycin A；C13-17 fengycin B547.6781.17葡萄灰霉fengycin类物质

3结论

葡萄病害是影响我国葡萄生产的重要问题之一，每年都造成葡萄不同程度的损失。据统计，我国葡萄生产每年因葡萄病害造成的损失在30%以上[22]。脂肽分子量较小、结构稳定，有研究表明，脂肽具有良好的抑制细菌、真菌性能及表面活性，是一种不可多得的新型抗生素，在医药、食品、日用品等行业有很大的应用潜力。解淀粉芽孢杆菌是第1批通过美国食品和药物管理局（FDA）安全认证的菌种，在国内农业部发行的微生物肥料生物安全技术通用准则（NY 1009—2006）也是免检菌种。解淀粉芽孢杆菌B15产脂肽含有抑制真菌的组分，在显微镜下观察发现，该抑菌成分能减少葡萄灰霉孢子的产生并造成菌丝体胀大，脂肽有效抑菌最低浓度为 0.017 mg/mL。经液相色谱和质谱仪的鉴定发现，脂肽主要抑菌成分为iturin A和fengycin类物质，这2种成分均对葡萄灰霉病菌有抑制作用，iturin A还能有效抑制酵母的生长，在生物农药方面有广阔的应用前景。

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