大叶山楝拮抗内生真菌DYSJ3的鉴定及抑菌活性产物分析

吴亚腾++吴曼莉++柳志强

摘要：从大叶山楝体内分离得到1株内生真菌DYSJ3，发现其对香蕉炭疽病菌、橡胶炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌具有较强的拮抗作用，皿内抑制率分别为61.9%、57.9%、55.3%和65.9%。通过形态学观察结合ITS序列分析，初步将菌株DYSJ3鉴定为杂色曲霉（Aspergillus versicolor）。对菌株DYSJ3产生的抑菌活性物质进行了初步分析，发现菌株DYSJ3的抑菌活性物质集中于菌丝体中，其菌丝体乙酸乙酯浸提物对多种植物病原真菌具有较强的抑菌活性，且热稳定性较好，100 μg/mL浸提物对香蕉炭疽病菌及苹果轮纹病菌具有明显抑制活性，抑制率分别为 72.7% 和62.0%。当浓度为1 000 μg/mL时，浸提物对香蕉炭疽病菌、苹果轮纹病菌、黄瓜枯萎病菌、橡胶炭疽病菌、小麦赤霉病菌的抑制率均大于90%。

关键词：大叶山楝；内生真菌；杂色曲霉；抑菌活性

中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0181-03

大叶山楝（Aphanamixis grandifolia）为楝科（Meliaceae）山楝属（Aphanamixis） 植物，主要分布于广东、广西、云南、海南等低海拔至中海拔山地沟谷密林或疏林地区，是一种传统的中药。《新华本草纲要》记载大叶山楝的根及叶具有祛风除湿、舒筋活络及通痹等功效，为祛风止痛药。据文献报道，大叶山楝中主要含有倍半萜、二萜、三萜等萜类成分和甾体等，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性[1-3]。Zeng等从大叶山楝中分离到四环三萜、倍半萜、木脂素、苯丙素、二肽类等化合物，并选出多个具有肿瘤细胞抑制活性的单体化合物[4]；黄淼等从大叶山楝根分离得到9 个化合物，发现多个化合物对慢性髓原白血病细胞K562和人胃癌细胞SGC-7901有生长抑制活性[5]。然而，目前关于大叶山楝内生真菌的研究鲜有报道。本研究从大叶山楝体内分离出1株内生真菌DYSJ3，发现其对多种植物病原菌具有较好的拮抗活性，通过形态观察结合ITS序列分析对该菌株进行鉴定，并对其产生的抗菌活性物质进行初步分析。

1材料与方法

1.1菌株

内生真菌DYSJ3从大叶山楝中经组织表面消毒分离获得。

供试真菌：香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum sp. cubense）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum sp. cucumerinum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、橡胶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengriana sp. piricola）由海南大学环境与植物保护学院提供。

1.2培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水 1 000 mL。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL。

CM培养基：胰化蛋白胨6 g，酵母提取物6 g，蔗糖10 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3菌种活化及平板拮抗试验

将内生真菌DYSJ3及植物病原真菌接种于PDA平板上，28 ℃培养5～7 d活化待用。用5 mm打孔器在培养5～7 d的供试内生真菌、病原真菌平板的菌落边缘取菌饼，将病原真菌置于PDA平板中央，菌株DYSJ3置于平板边缘，以只接种病原真菌的PDA平板为对照，每个处理3个重复，28 ℃培养5～7 d，测量菌落半径（mm），计算抑菌率。抑菌率=（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径×100%。

1.4菌株DYSJ3鉴定

将菌株DYSJ3接种于PDA培养基上，28 ℃培养3～7 d，从第3天开始每天挑取少量菌丝于载玻片上，在显微镜下观察气生菌丝、分生孢子等，拍照并描述特征。

菌株基因组DNA提取采用CTAB法[6]，利用ITS通用引物（ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。 PCR反应体系为：10×buffer 2.5 μL，Taq酶0.25 μL，dNTPs 2 μL，ITS 1 0.5 μL，ITS 4 0.5 μL，dH2O 18.25 μL，模板1 μL，总体积 25 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸 30 min。将所得产物用纯化试剂盒回收，连接到pMD18-T Vector，由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，将所测序列在GenBank 中（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行Blast分析。用Clustal X （1.83） 软件进行多序列比对（Multiple alignments），利用MEGA 5.0软件以邻近相接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统进化树。

1.5菌株DYSJ3粗提物的制备及活性测定

菌株DYSJ3活化后，接种于5 L的PDA液体培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养7 d，室温避光静置21 d。将菌丝体和发酵液用8层纱布过滤分离，充分洗净菌丝体。发酵液浓缩为浸膏后备用。菌丝体用95%乙醇浸泡后超声破碎1 h，再用8层纱布过滤获得乙醇浸出液，浓缩为浸膏后备用。

配制香蕉炭疽菌的孢子悬浮液（1×107 CFU/mL），混入PDA 平板中，制备带菌平板。将获得的发酵液及菌丝体浸膏用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇进行浸提，获得各溶剂层浸膏，丙酮溶解，利用牛津杯法检测其拮抗活性[7]。

1.6菌株DYSJ3粗提物热稳定性及抗菌谱测定

热稳定性试验：使用香蕉炭疽病菌制备带菌平板，将DYSJ3粗提物置于120 ℃处理1 h，利用牛津杯法检测其活性。

抗菌谱测定：将DYSJ3菌丝体乙酸乙酯粗提物用丙酮完全溶解后混入PDA培养基，制成浓度分别为100、500、1 000 μg/mL 的平板，以加丙酮PDA平板为对照组。用直径5 mm打孔器在供试病原菌菌落边缘取菌饼接于平板中央，每处理3个重复，28 ℃培养3～7 d，十字交叉法测量所有处理菌落生长直径（mm），按如下公式计算菌丝生长抑制率[8]：

菌丝生长抑制率=[（对照菌落直径-5）-（处理菌落直径-5）]/（对照菌落直径-5）×100%。

2结果与分析

2.1菌株DYSJ3皿内拮抗活性

利用对峙生长法测试了菌株DYSJ3对4种植物病原真菌的皿内拮抗活性，结果见表1、图1，内生真菌DYSJ3对香蕉炭疽病菌、橡胶炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌具有明显的拮抗作用，皿内抑制率均大于50%。

表1菌株DYSJ3对4种植物病原真菌的皿内抑制率

供试病原真菌抑菌率（%）香蕉炭疽病菌61.9橡胶炭疽病菌57.9香蕉枯萎病菌55.3芒果炭疽病菌65.9

2.2菌株DYSJ3鉴定

菌株DYSJ3在PDA培养基上生长缓慢，培养14 d直径 3～6 cm，菌落呈不规则圆形、紧密，培养基正面颜色有数环，从青绿到红绿，背面颜色有青黄、红褐色等。分生孢子头的顶囊近球形，顶囊着生小梗，小梗有单层、双层、单双层同时生在1个顶囊上，顶端有链形孢子、近球形孢子，无色（图2）。对菌株DYSJ3的ITS序列进行PCR扩增，测序得到 598 bp 的碱基序列。将得到的ITS序列进行Blast分析，发现其与杂色曲霉的亲缘关系最近，相似度达到100%。选取多株曲霉属菌株与DYSJ3的ITS序列，利用MEGA 5.0构建系统发育树（图3），DYSJ3在系统进化树中与Aspergillus versicolor在同一分支上，结合形态学特征初步将DYSJ3鉴定为杂色曲霉（Aspergillus versicolor）。

2.3菌株DYSJ3粗提物制备及活性分析

利用牛津杯法测试了菌株DYSJ3发酵液及菌丝体粗提物对香蕉炭疽病菌的拮抗作用，结果发现DYSJ3发酵液粗提物对病原菌无拮抗作用，菌丝体乙酸乙酯浸提物具有明显的拮抗活性（图4-A）。由此可见，菌株DYSJ3的抑菌活性物质集中于菌丝体中。将菌丝体乙酸乙酯浸提物置于120 ℃处理1 h后测试拮抗活性，抑菌圈与对照组相比无显著变化（图4-B），可见菌株DYSJ3产生的抑菌活性物质具有较好的热稳定性。

将菌株DYSJ3菌丝体乙酸乙酯浸提物配制成不同浓度（100、500、1 000 μg/mL），测试了其对6种植物病原菌的拮抗活性，结果见表2、图5。菌丝体乙酸乙酯浸提物在1 000 μg/mL 浓度时对香蕉炭疽病菌、苹果轮纹病菌、黄瓜枯萎病菌、橡胶炭疽病菌、小麦赤霉病菌抑制率均大于90%，对香蕉炭疽病菌及苹果轮纹病菌菌丝抑制明显，500 μg/mL浓度下抑制率分别达到93.5%和87.3%。

3讨论

从微生物次生代谢产物中筛选抗生素是新药开发的一个重要途径，随着近年来对新型抗生素需求的增加，植物内生菌次生代谢产物的研究受到了广泛的关注。药用植物内生真菌多样性十分丰富，由于特殊的生存环境，药物植物内生真菌在生长和代谢过程中可以产生各种具有特殊化学结构类型和特殊生理功能的活性物质，这是研究开发农药先导化合物珍贵的原料宝库。

本研究对分离自药用植物大叶山楝内生真菌DYSJ3进行了鉴定，初步鉴定为曲霉属杂色曲霉。目前有关杂色曲霉次生代谢产物的研究有部分报道，董世豪等从相似蜂海绵分离到1株海洋真菌杂色曲霉F62，从中分离得到了6 个化合物，分别为Alantrypinone、洛伐他汀、甲酯型莫纳克林K、土曲霉酮、土震素B和麦角甾醇，其中土曲霉酮具有体外抗炎活性[9]；巩婷等从海洋真菌杂色曲霉 F62 中分离得到6个丁内酯类化合物，其中丁内酯Ⅰ表现出较强的抗炎活性[10]；赵彩桂从杂色曲霉中分离鉴定了22个化合物，主要为没药烷型倍半萜、二苯醚类化合物、生物碱和甾体[11]；王香粉从海洋真菌杂色曲霉菌发酵液中分离纯化得到 7 个化合物，包括 5-methylbenzene-1，3-diol、吡咯并哌嗪-1，4-二酮、3-（hydroxymethyl）cyclopentanol、3-异丙基-吡咯并哌嗪 2，5-二酮、6-甲氧基柄曲菌素等[12]。然而，目前尚未有将杂色曲霉用于植物真菌病害防治的研究。本研究发现菌株DYSJ3菌丝体乙酸乙酯浸提物对6种植物病原真菌具有较强的抑制能力，具有广谱抗菌性，热稳定性较好，具有开发的潜力。本研究为下一步进行菌株DYSJ3抑菌活性物质的分离、鉴定及应用奠定了良好的基础。

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