贝母组培物提取物的质量标准研究

刘　玮， 张　倩， 孙　婷， 覃盼盼， 刘　涛， 王跃华

(1.绵阳市食品药品检验所， 四川 绵阳　621000； 2.成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都　610106)



贝母组培物提取物的质量标准研究

刘玮1， 张倩2， 孙婷2， 覃盼盼2， 刘涛2， 王跃华2

(1.绵阳市食品药品检验所， 四川 绵阳621000； 2.成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都610106)

摘要：目的:研究贝母组培物提取物的质量控制方法. 方法：采用薄层色谱法，紫外分光光度法进行定性鉴别和定量鉴别，通过测定总灰分、酸不溶灰分对提取物所含杂质的量进行控制，采用热浸法对水溶性浸出物和醇溶性浸出物的含量进行测定. 结果：定性鉴别薄层色谱特征明显，专属性强；水溶性浸出物不少于72.69%，醇溶性浸出物不少于75.95%，总灰分的检查限度为不超过11.89%.建立了贝母组培物提取物中西贝母碱的含量测定方法，回归方程为Y=7.7591X+0.0437(R2=0.9991).平均加样回收率为98.7541%，回收率RSD=1.3067%.结论：定性鉴别和含量测定方法操作简便，重复性好，可有效控制贝母组培物提取物的质量.

关键词：薄层色谱法；贝母组培物提取物；西贝母碱；质量标准

0引言

川贝母为百合科贝母属的多种植物的干燥鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳之功效，可用于治疗痰热咳喘，咯痰黄稠等证[1].川贝母目前属于濒危药材[2-4]，为了解决资源短缺问题，本课题组采用细胞悬浮培养方法获得了川贝母组培药材，其中药材提取物具有一系列的优势[5]，同时，本课题组已建立了川贝母组培物提取物的工艺路线.为了更好地控制川贝母药材质量，本研究对其进行了总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、重金属等项目的测定，并以西贝母碱为指标性成分进行定性鉴别和含量测定，建立了贝母组培物提取物的质量标准，拟为贝母组培物提取物的质量控制提供依据.

1仪器与试药

1.1药品与试剂

实验所用药品与试剂包括：川贝母组培物提取物，自制(批号，20140328、20140601、20140605)；西贝母碱对照品(批号，110767-201107)、贝母素乙(批号，110751-201110)、贝母素甲(批号，110750-201110)，均购自国家食品药品检定研究所；纯净水(杭州娃哈哈集团) ，三氯甲烷、甲醇、氨水均为分析纯.

1.2仪器

实验所用仪器包括：KQ-100E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BS-6KH电子天平(上海良平仪器有限公司)，UV-1100D型紫外分光光度计(上海美谱达有限公司)，RE-501恒温水油浴锅(成都康宇科技有限公司)，SH2-DⅢ循环水式多用真空泵，真空干燥箱(北京科伟仪器有限公司).

2方法与结果

2.1薄层色谱鉴别

2.1.1对照品制备.

取西贝母碱对照品适量，加三氯甲烷制成每1 mL含0.2 mg溶液，作为对照品溶液；取贝母素乙对照品适量，加三氯甲烷制成每1 mL含1 mg溶液，作为对照品溶液.

2.1.2对照组制备.

取贝母组培物粉末10.0 g,加浓氨试液10 mL,密塞，浸泡1 h，加二氯甲烷40 mL,超声处理1 h，再加20 mL二氯甲烷，超声5～6 min.滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为对照组.

2.1.3供试品制备.

取各批贝母组培物的提取物1.0 g，加浓氨试液10 mL，密塞，浸泡1 h，加二氯甲烷40 mL，超声处理1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液.

2.1.4实验方法.

吸取适量供试品和对照品分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯—甲醇—浓氨试液—水(18∶2∶1∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，依次喷以稀硫酸铋钾和亚硝酸钠乙醇试液，供试品与对照品在相同位置显相同颜色斑点，结果如图1所示.

1.西贝母碱对照品；2.贝母素乙对照品；3、4、5.样品；6.贝母组培物

图1贝母组培物提取物TLC

2.2总灰分

本实验按《中国药典》(2010版) 一部附录Ⅸ K测定总灰分.根据3批9组样品测定结果分析，测定结果最高值11.61%，平均值9.90%.故暂定总灰分的检查限度为不超过11.88%.

2.3酸不溶灰分

本实验按《中国药典》(2010版) 一部附录Ⅸ K测定酸不溶灰分.根据3批9组样品测定结果分析，测定结果最高值0.15%，平均值0.13%.故暂定总灰分的检查限度为不超过0.16%.

2.4浸出物

2.4.1水溶性.

本实验按《中国药典》(2010版) 一部水溶性浸出物热浸法测定.根据3批6组样品测定结果分析，均值90.86%.故暂定水溶性浸出物不少于72.69%.

2.4.2醇溶性.

本实验按《中国药典》(2010版) 一部醇溶性浸出物热浸法测定.根据3批6组样品测定结果分析，平均值94.93%.故暂定醇溶性浸出物不少于75.95%.

2.5含量测定

2.5.1对照品溶液制备.

取贝母对照品(西贝母碱)约10 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加三氯甲烷适量并稀释至刻度，摇匀，得0.2 mg/mL对照品溶液.

2.5.2最大吸收波长测定.

取样品溶液，以三氯甲烷∶溴甲酚绿∶水(30∶2∶10)作为空白对照进行紫外波长扫描，对照品与供试品在波长412 nm处均有较大吸收，故选择412 nm为最大吸收波长，其图谱如图2所示.

a.空白对照；b.对照品；c.供试品

图2贝母组培物提取物紫外全波长扫描图

2.5.3样品的处理方法考察.

取贝母组培物的提取物0.3 g(批号，20140328)，精密称定，以一已知浓度的对照品作为参照，通过不同的方法处理后定容，比较吸光度，即可知浓度大小.确定回流比超声处理吸光度高，回流2 h较1 h、1.5 h时吸光度高，加入三氯甲烷∶甲醇(4∶1)混合溶液40 mL较加入相同溶液20 mL吸光度高.

综上所述，样品的处理方法为：取样0.3 g，精密称定，精密加入3.0 mL氨水回流2 h，加入三氯甲烷∶甲醇(4∶1)混合液40 mL回流2 h，放冷，滤过，滤液置50 mL量瓶中，加三氯甲烷∶甲醇(4∶1)混合溶液至刻度，摇匀，待用.

2.5.4供试品溶液制备.

经单因素考察方法处理制得的样品分别精密量取3.0 mL，置于25 mL容量瓶中，水浴上蒸干，加三氯甲烷10 mL,精密加水5 mL，再精密加0.05%溴甲酚绿缓冲液2 mL，密塞，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30 min.取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，待用.

2.5.5标准曲线绘制.

精密吸取西贝母碱对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，精密加水5 mL，加0.05%溴甲酚绿缓冲液2 mL,密塞，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30 min，取续滤液，按紫外分光光度法在波长412 nm处测定Abs，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程，Y=0.7591X+0.0437(R2=0.9991).结果表明，西贝母碱在0.002～0.02 mg与吸光度呈良好的线性关系.

2.5.6精密度实验.

吸取同一样品溶液6份， 按“2.5.4”项下方法制备供试品溶液，测得其吸光度RSD=1.15%，表明本方法精密度较好.

2.5.7稳定性实验.

取贝母组培物的提取物0.3 g，精密称定，制成样品溶液，按“2.5.4”项下方法制备供试品溶液，分别于0、5、10、15、20、30 min时依法测定Abs，其吸光度RSD=1.28%，表明供试品溶在30 min内稳定性较好.2.5.8重复性实验.

取贝母组培物的提取物0.3 g，精密称定，制成样品溶液，按“2.5.4”项下方法制备供试品溶液，分别测定Abs，计算西贝母碱含量，其RSD=1.49%，表明本方法重复性较好.

2.5.9加样回收率实验.

精密称取贝母组培物提取物(批号，20130328，含西贝母碱，12.04 mg/g)样品6份，等量加入西贝母碱对照品，制成样品溶液，按“2.5.4”项下方法制备供试品溶液，分别测定Abs，计算回收率.西贝母碱的平均回收率为98.75%，回收率RSD=1.31%，结果见表1.

表1　西贝母碱加样回收率

2.5.10样品测定.

取3批贝母组培物的提取物0.3 g，精密称定，制成样品溶液，再按“2.5.4”项下方法制备供试品溶液，分别测定Abs，计算样品中西贝母碱的含量，每批药材各平行操作2份，结果见表2.

表2　贝母组培物提取物中西贝母碱含量测定

根据6批样品测定结果分析，测定结果最高值为1.1255%，平均值为1.1091%，故暂定西贝母碱的含量不得低于0.8873%.

3讨论

采用现代生物技术进行中药材培育是解决资源紧缺中药材供给的一种有效方式.本课题组建立了贝母组培物的培育方法，能够规模化地生产贝母组培物.为了有效保存药材，课题组对贝母组培物提取物制备工艺进行了研究，目的是为了保证提取物的质量，并建立其质量标准.

参照《中国药典》2010版(一部) 中贝母的鉴别方法,采用硅胶G对贝母组培物的提取物进行薄层色谱研究，并以贝母素甲、贝母素乙、西贝母碱为对照品，以乙酸乙酯—甲醇—氨水—水(18∶2∶1∶0.1)为展开剂,分别对3批提取物采用薄层鉴别方法进行研究.结果表明，用甲醇直接溶解样品分离现象不明显，没有出现具体的斑点，只有一条展开带；而经氨水浸泡，再超声处理的样品分离效果较好.

有文献采用HPLC-ELSD法测定西贝母碱的含量[7]，本研究参照《中国药典》的方法，采用紫外分光光度法进行含量测定.实验结果表明，该法也可较好地测定西贝母碱的含量.

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2]何先元.贝母类药材资源分布及性状特点研究[J].中国药房，2009,20(6):479-480.

[3]杨惠莲,吴佳.法定标准收载贝母类药材及其常见伪品概述[C]//2008年成渝药学学术年会论文集.2008:622.

[4]闫博华,丁红,丰芬,等.不同基源川贝母研究进展[J].四川中医,2010,28(5):48-50.

[5]王智民,肖诗鹰,钱忠直.加速中药标准提取物发展,推动中药现代化和国际化[J].中国中药杂志,2007,32(17):1830-1833.

[6]T宪楷.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社,1988.

[7]霍务贞,朱盛山,邬威尧,等.HPLC-ELSD测定蛇胆川贝散生产过程西贝母碱的含量变化[J].中国方剂学杂志,2012,18(3):93-95.

Quality Standards for Extracts of Fritillaria Tissue Cultures

LIUWei1,ZHANGQian2,SUNTing2,QINPanpan2,LIUTao2,WANGYuehua2

(1.Institute for Food and Drug Control, Mianyang 621000, China;2.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

Abstract:The paper is going to study the quality control of the extracts of fritillaria tissue cultures.TLC and ultraviolet spectrophotometry are used for qualitative and quantitative identification.By measuring the total ash and acid insoluble ash,the amount of impurities contained in the extracts is controlled.Hot-dip method is used to measure the content of water-soluble extracts and alcohol-soluble extracts.The results show that the TLC results of qualitative identification take on obvious characteristics and strong specificity;water-soluble extract is no less than 72.69%;alcohol-soluble extract is no less than 75.95%;the inspecting limit of total ash is no more than 11.89%.The content measurement system for measuring the content of sipeimine in extracts of fritillaria tissue cultures is established.The regression equation is y=7.7591x+0.0437,R2=0.9991.The average recovery is 98.7541%,and the recovery RSD=1.3067%.The conclusion drawn in the paper is that qualitative identification and content determination method is simple,reproducible,and can effectively control the quality of the extracts of fritillaria tissue cultures.

Key words:TLC;extracts of fritillaria tissue cultures;sipeimine;quality standards

文章编号：1004-5422(2016)02-0124-04

收稿日期：2016-01-14.

基金项目：成都市经济和信息化委员会科研计划(2012)资助项目.

作者简介：刘玮(1976 — )， 男， 主管中药师， 从事中成药与保健品检验研究.

中图分类号：R284.2；S567.23+1

文献标志码：A