油田本源微生物胞外聚合物产生菌AD-05发酵条件的实验室评估

杜国丰，关云虎（营口理工学院 化学工程系，辽宁 营口 115014）



油田本源微生物胞外聚合物产生菌AD-05发酵条件的实验室评估

杜国丰，关云虎
（营口理工学院 化学工程系，辽宁 营口 115014）

摘要：对一株筛选自辽河油田油水样的生物聚合物产生菌AD-05进行了发酵条件的室内评估。结果表明：菌株AD-05为一株革兰氏阴性杆菌，菌落数、发酵液黏度及多糖产量具有很好的相关性。菌株在pH=8.0下，培养27 h，多糖产量达到25.2 mg·mL-1，黏度为59.96 mPa·s；能够耐受8%NaCl。发酵产物胞外多糖在80 ℃下放置30 h黏度变化不明显。菌株AD-05的发酵特性为其应用于油藏出油率低、地层条件复杂的采油矿场提供了可能性。

关键词：菌株AD-05；生物聚合物；黏度；聚合物驱油

微生物采油技术是一项利用微生物的代谢产物来调节、改善油藏条件，降低渗透率，扩大水驱范围，从而提高采收率的技术。用于采油的微生物代谢产物主要有表面活性剂、有机酸、气体、生物聚合物等，它们能够改善油藏条件，使原油易于流动，从而提高采收率［1］。目前，国内多数油田在聚合物驱后，地下油层中仍有近50%的原油未被开采，仅依靠常规技术进一步采出剩余油的难度非常大［2］。

本试验前期从辽河油田金马采油作业二区2083井附近油水样中筛选出一株高产生物聚合物的菌株AD-05，经初步鉴定产物为胞外多糖。本文对该菌的发酵特性进行了实验室评估，并对产物的高温稳定性进行了考察，以期用于微生物驱油的现场试验。

该菌与已报道的用于驱油的微生物相比，它的产量在50 ℃时仍能达到7.3 mg·mL-1，是一株高产生物聚合物的菌株，在中温油藏环境下对于微生物的调驱有着很好的应用前景。一方面产物溶于水黏度较高，增强了注入水的推动力，提高驱油效率；另一方面，大量的微生物菌体可对渗透层进行封堵，扩大注入水的波及范围，使三次、四次采油的采收率大大提高［3］。

1　实验部分

1.1菌体及培养基

生物聚合物产生菌 AD-05（筛选自辽河油田油水样）；

LB培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，NaCl 5 g/L，pH=7.2；

生物聚合物发酵培养基：4 g葡萄糖+2 g玉米浆+ 0.l g Na2HPO4+0.05 g K2HPO4+0.3 g NaNO3+0.05 g MgSO4+0.05 g CaC12+100 mL蒸馏水；

1.2仪器及试剂

仪器：BJ-2CD型超净工作台（上海博迅实业有限公司），KZD-C型双层空气恒温振荡器（金坛市国旺实验仪器厂），TDL-40B型台式离心机（上海安亭科学仪器厂），LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），PHS-3C型精密pH计（上海虹益仪器仪表有限公司），0.8、1.0、1.2、1.5 mm品氏黏度计（上海睿齐实业有限公司）、GZX-9146MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）。

试剂：革兰氏染液、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、无水乙醇等，上述药品均为国产分析纯。

1.3试验方法

1.3.1革兰氏染色观察

将生物聚合物产生菌AD-05按2%接种量接种到LB液体培养基中，37 ℃、150 r/min振荡培养过夜，取发酵液进行革兰氏染色，观察菌落形态。

1.3.2胞外多糖粗品的制备

将1.3.1中的发酵液5 000 r/min离心10 min，弃沉淀，向上清液中添加无水乙醇（上清液：无水乙醇=1：2），放置于4 ℃冰箱中3 h后取出5 000 r/min离心10 min，沉淀再次用少许无水乙醇洗涤，烘干至恒重，得胞外多糖粗品［4］。

1.3.3 发酵液中菌落数、黏度、胞外多糖产量的测定

按照2%的接种量将LB富集液转接到生物聚合物发酵培养基中，37 ℃、150 r/min振荡培养30 h，每隔3 h取100 µL菌液，稀释到相应倍数，使得平板涂布菌落数在 30～300之间，菌落计数后计算菌液中菌落形成单位数（cfu）、利用品氏黏度计测定发酵液黏度、利用苯酚硫酸法［5］测定发酵液中生物聚合物胞外多糖的产量。

1.3.4 不同温度下发酵液黏度、胞外多糖产量的测定

分别在30、40、50、60、70 ℃下，按照2%的接种量将菌株 AD-05接种于生物聚合物发酵培养基，150 r/min振荡培养27 h，测定不同温度下发酵液的黏度及多糖产量。

1.3.5 不同pH下发酵液黏度、胞外多糖产量的测定

分别在pH=3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0下，按照2%的接种量将菌株AD-05接种于生物聚合物发酵培养基，150 r/min振荡培养27 h，测定不同pH下发酵液的黏度及多糖产量。

1.3.6 不同NaCl浓度下发酵液黏度、胞外多糖产量的测定

在生物聚合物发酵培养基中分别添加0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的NaCl，按照2%的接种量将菌株AD-05接种于培养基中，150 r/min振荡培养27 h，测定不同盐度下发酵液的黏度及多糖产量。

1.3.7高温下产物黏度的测定

将AD-05发酵所产的胞外多糖粗品配成2%的溶液，放置于80 ℃鼓风干燥箱内，每隔3 h测定其黏度，记录其黏度随时间的变化情况。

2　结果与讨论

2.1菌落形态

AD-05的菌落形态如图1所示。平板上菌落单一，表层干燥，边缘较光滑，轻轻挑动有拉丝现象。菌株AD-05经革兰氏染色观察呈杆状，为革兰氏阴性菌（图2）。

图1　菌株AD-05在LB平板上的状态Fig.1 The state of strain AD-05 on LB plate

图2　菌株AD-05革兰氏染色形态Fig.2 Strain AD-05 gram stain morphology

2.2多糖粗品的外观形态

菌株AD-05的发酵液经5 000 r/min离心后上清液利用2倍的无水乙醇沉淀，加入乙醇立即出现絮状沉淀，且呈可挑挂的状态（如图3、图4），说明AD-05发酵所产的生物聚合物为胞外多糖。

图3　AD-05上清液乙醇沉淀多糖析出Fig.3 AD-05 supernatant ethanol precipitation

2.3发酵液中菌落数、黏度、胞外多糖产量之间的相关性

菌株AD-05在接种的前12 h，基本上处于生长延滞期，到15 h以后菌株生长进入对数生长旺期，至27 h后逐渐进入稳定期，此时多糖产量可达22.3 mg·mL-1，发酵液黏度为54.68 mPa·s，从图5中可以看出，菌落数、多糖含量、发酵液黏度三者之间呈现很好的相关性。

图4　呈可挑挂的AD-05胞外多糖Fig.4 AD-05 extracellular polysaccharide

图5　不同培养时间下菌落数与黏度、多糖产量三者之间的关系曲线图Fig.5 The relationship curves of the colony number，viscosity and the yield of polysaccharide in different culture

2.4温度对发酵液黏度、胞外多糖产量的影响

图6　温度对AD-05发酵液黏度及多糖产量的影响Fig.6 Effect of temperature on viscosity and yield of polysaccharide in AD-05 fermentation broth

菌株AD-05在30、40、50、60、70 ℃下振荡培养27 h后，多糖含量与黏度之间的关系如图6所示。从图6中可以看出，升高温度对AD-05发酵代谢产胞外多糖不利，在40 ℃时，多糖产量达到22.6 mg·mL-1，此时的黏度为55.87 mPa·s；在50 ℃下，培养27 h，多糖产量、发酵液黏度均明显降低，但仍可达7.3 mg·mL-1和25.32 mPa·s；当温度升高到60 ℃时，仍可见AD-05代谢产物有多糖产生；但当温度升高至70 ℃时，AD-05几乎不生长，说明菌株AD-05的最佳发酵温度在40 ℃左右。

2.5 pH对发酵液黏度、胞外多糖产量的影响

利用生物聚合物发酵培养基，在 pH=3.0～11.0范围内150 r/min振荡培养27 h后，多糖产量与黏度之间的关系如图 7所示。从图中可以看出，pH=8.0的条件对AD-05发酵产胞外多糖是有利，且此时多糖产量达到25.2 mg·mL-1，黏度达到59.96 mPa·s，初步说明弱碱性的环境对AD-05产聚合物是有利的。

图7　pH对AD-05发酵液黏度及多糖产量的影响Fig.7 Effect of pH on viscosity and yield of polysaccharide in AD-05 fermentation broth

2.6盐度对发酵液黏度、胞外多糖产量的影响

如图8所示，培养基中添加不同浓度的NaCl时，随着盐浓度的增大AD-05生长状况越来越差，不过AD-05在不高于8% NaCl浓度时，多糖的产量均在30 mg·mL-1以上，甚至在12% NaCl浓度的条件下培养，亦有胞外多糖产生。说明菌株AD-05是一株耐高矿化度的胞外多糖高产菌种。

图8　NaCl浓度对AD-05发酵液黏度及多糖产量的影响Fig.8 Effect of NaCl concentration on viscosity and yield of polysaccharide in AD-05 fermentation broth

2.7高温对产物黏度的影响

将AD-05发酵液利用乙醇沉淀后，5 000 r/min离心，再次用无水乙醇洗涤，于80 ℃下烘干至恒重。用去离子水配成 2%的粗多糖溶液，其初始黏度为50.71 mPa·s，将此水凝胶溶液放置于80 ℃下，每隔3 h测定一次黏度，记录其黏度的变化情况（见图9）。从图中可以看出，随着时间的延长，黏度有些许下降，但经过30 h黏度也仅仅是下降到47.78 mPa·s。说明菌株 AD-05所产的生物聚合物胞外多糖在80 ℃下具有较好的稳定性，对其黏度影响不大。

图9　80 ℃时，AD-05胞外多糖黏度的变化曲线Fig.9 The change curve of viscosity of AD-05 polysaccharides at 80 ℃

3　结 论

本文中生物聚合物产生菌 AD-05筛选自辽河油田的油水样，经革兰氏染色观察为一株革兰氏阴性杆菌，代谢产物经乙醇沉淀为呈可调挂的胞外多糖聚合物。该聚合物在添加了玉米浆的生物聚合物培养基中培养27 h达到对数生长顶峰期，此时多糖产量可达22.3 mg·mL-1，发酵液黏度为54.68 mPa·s；在50 ℃下，培养27 h，多糖产量仍可达7.3 mg·mL-1，发酵液黏度为25.32 mPa·s。通过在不同pH下培养，发现菌株AD-05在偏碱性的条件（pH=8.0）下多糖产量和发酵液黏度均达到最佳，分别为25.2 mg·mL-1和59.96 mPa·s；在模拟地下岩层矿化度（本文以NaCl浓度为参考）情况下，发现菌株AD-05能够耐受一定的盐度，在8%以下的NaCl浓度下，AD-05可以很好的生长，且多糖产量及发酵液黏度也具有很好的相关性；最后对AD-05所产的胞外多糖的耐温性进行了考察，在80 ℃的条件下放置30 h，黏度变化不明显。菌株AD-05的这些发酵性能为其应用于目前油藏出油率低、地层条件复杂的采油矿场提供了可能性。

本源微生物在油藏条件下能够生长，发酵周期短，能够在廉价原料制成的培养基中生长，且代谢产物产量高，易于回收。大多数成功的油田试验所采用的菌种都具有产气、产酸、生物聚合物和表面活性剂的能力，这些代谢产物对提高驱油效率非常有益［6］。从经济角度来看，营养物最好是以烃类为主，添加少量其它营养物质［7］。糖蜜是微生物生长的良好营养物，已在许多矿场试验中采用［8］。从安全角度来看，本文中的菌种属非致病菌，不产生任何有害的生物毒素，对动物和植物都不产生毒害作用。

生物聚合物产生菌在多孔介质中生长状况良好，对高渗透层有良好的封堵作用，生物聚合物注入岩心后有效封堵高渗层，使得调剖后注入压力明显提高，从而提高原油的采收率［9-11］。

参考文献：

［1］Van Hamme J D，Singh A，Ward O P.Recent advances in petroleum microbiology［J］.Microbiol.Mol.Biol.Rev.，2003，67：503-49.

［2］石梅.聚合物驱后利用微生物进一步提高采收率的可行性［J］.大庆石油地质与开发，2004，22 （2） ∶56-60.

［3］宋考平，李世军，方伟，等.聚合物驱油过程中聚合物滞留及残余油分布的数值模拟研究［J］.石油学报，2005，26（2） ∶92-95.

［4］张霞，聂少平，李昌，等.夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究［J］.食品工业科技，2012，33 （20） ∶87-90.

［5］池源，王丽波.苯酚-硫酸法测定南瓜籽多糖含量的条件优化［J］.食品与机械，2014，30 （1） ∶89-92.

［6］史权.微生物提高原油采收率技术的发展及应用［J］.世界石油工业，1997，4 （10） ∶38-42.

［7］韩培慧，石梅，等.以烃类为碳源的微生物驱油探索研究［J］.大庆石油地质与开发，2001，20 （2） ∶41-43.

［8］黄第潘.石油微生物学［M］.北京：石油工业出版社，1991.

［9］宋义伟，吕自红，巨等峰.聚合物凝胶与微生物调驱联作技术应用研究［J］.石油与天然气化工，2006，35 （3） ∶217-221.

［10］孙尚如，何先华，邬侠，等.聚合物驱后剩余油分布核磁成像实验研究［J］.大庆石油地质与开发，2003，22 （4） ∶61-63.

［11］冯其红，李平，何长，等.注聚合物后转后续水驱油田整体调剖研究［J］.石油大学学报：自然科学版，2001，25 （2） ∶59-61.

Laboratory Evaluation of the Fermentation Conditions of the Bio-polymer Producing Bacteria AD-05 From Oil Field Source

DU Guo-feng，GUAN Yun-hu
（Department of Chemical Engineering，Yingkou Institute of Technology，Liaoning Yingkou 115014，China）

Abstract：In this paper，a screening of the bio-polymer producing bacteria AD-05 from the oil samples of the Liaohe oil field was carried out to evaluate the fermentation conditions.The results show that the strain AD-05 is gram negative bacilli；the number of colonies，the viscosity of the fermentation broth and the yield of polysaccharide have a good correlation.The yield of polysaccharide is 25.2 mg·mL-1，the viscosity is 59.96 mPa·s at pH=8.0；the strains are able to tolerate 8% NaCl.The extracellular polysaccharide of fermentation products was placed 30 h at 80 degree，the change of viscosity was not obvious.The fermentation characteristics of strain AD-05 can provide the possibility for its application in the oil production field with low oil yield and complex formation conditions.

Key words：Strain AD-05；Bio-polymer；Viscosity；Polymer flooding

中图分类号：TQ 028

文献标识码：A

文章编号：1671-0460（2016）01-0044-04

收稿日期：2015-10-15

作者简介：杜国丰（1984-），男，辽宁营口人，实验师，硕士，2009年毕业于沈阳农业大学生物化学与分子生物学专业，研究方向：从事生物化工方面的研究。E-mail：duguofeng885624@163.com。