山羊颞下颌关节盘胶原构筑和生物力学性能研究

李燕梅包广洁，2钟妮吕玮张文霞王兰兰康宏

1.兰州大学口腔医学研究所，兰州 730000；2.西北民族大学口腔医学国家民委重点实验室，兰州 730030；3.兰州大学生命科学学院，兰州 730000



山羊颞下颌关节盘胶原构筑和生物力学性能研究

李燕梅1包广洁1，2钟妮1吕玮1张文霞1王兰兰3康宏1

1.兰州大学口腔医学研究所，兰州 730000；2.西北民族大学口腔医学国家民委重点实验室，兰州 730030；3.兰州大学生命科学学院，兰州 730000

［摘要］目的 为工程化颞下颌关节盘组织建立客观的生物力学标准。方法 从4只健康1月龄山羊头中完整分离8个颞下颌关节盘，用直径3 mm的冲子在前、中、后带取圆柱状试样，预处理压缩速度为0.025 mm·s-1，结束条件为最大载荷小于4.9 N，压缩位移1.5 mm，循环3次，在预处理基础上完成压缩实验，获取各区带的应力应变关系图和弹性模量值。扫描电子显微镜和偏振光显微镜观察各区带的超微结构和胶原纤维走向。结果 1）关节盘组织的生理应变范围在10%以内，关节盘组织的拟线性本构方程可以用多项式y=ax+bx2+cx3进行拟合。2）关节盘中间带的弹性模量值最大，其与前带和后带均有统计学差异（P＜0.05），前带与后带之间无统计学差异（P=0.361）。3）颞下颌关节盘内部呈现环形胶原网状结构，中间带胶原排列致密，呈前后向排列；前带和后带主要呈内外走向，伴有前后方向的纤维。结论 环形胶原网状结构是山羊颞下颌关节盘抗力性能的基础，中间带抗压性能高于前带和后带。

［关键词］颞下颌关节盘； 拟线性本构方程； 压缩实验； 弹性模量； 扫描电子显微镜； 偏振光显微镜

颞下颌关节盘（temporomandibular joint disc，TMD）是下颌髁突和颧骨关节窝之间的纤维软骨样组织，主要由成纤维样细胞和软骨样细胞构成。国外研究［1］报道，50%～75%的人至少有过单侧颞下颌关节疼痛的经历，其中33%的人至少有一次持续性关节疼痛症状。我国颞下颌关节盘的既往功能紊乱患病率为18.3%，但临床检查功能紊乱患病率为54.2%，女性高于男性［2-3］。学者［4-5］认为颞下颌关节病可能是由精神因素、因素、其他因素（如行为习惯、创伤、自然环境、代谢、免疫、关节形态发育异常等）综合导致，其中大约70%的关节疾病与关节盘的病变有关，多以关节盘变薄、透明样变、穿孔为主要特征。正常情况下，颞下颌关节盘具有良好的抗压特性，但在受到不正常的压力或穿孔后，一般不能自我修复。近年来，组织工程化颞下颌关节盘的研究为临床治疗关节盘疾病提供了一条新途径，但是这一领域的研究存在的主要问题有：没有理想的细胞源和合适的动物模型、支架的生物学功能匹配性差、工程化组织的强度和功能与正常组织有较大差异等，制约了这项工作的开展［6］。

研究［7-8］表明，山羊的颞下颌关节盘在形态、结构和功能方面较其他动物更接近于人。笔者在前期的实验中对山羊关节盘的形态学、组织学以及免疫组织化学进行了初步分析［9］，证明用山羊作为组织工程化颞下颌关节盘研究的动物模型是可行的［10］。对山羊关节盘的生物力学性能进行表征，将为工程化颞下颌关节盘组织建立客观的评价标准，为功能性组织工程的深入研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

Instron 5960系列双立柱台式微力试验机（Instron公司，美国），是一款电子万能微力试验机，可用于各种组织原材料、复合材料、塑料、橡胶材料和金属等的压缩、拉伸以及剪切力学性能的测试，与Bluehill 3软件配套使用。

1.2 标本收集

从当地屠宰场购买新鲜屠宰的健康1月龄山羊头4个，清洗干净后在75%乙醇中浸泡半小时，然后在超净工作台内完整切取双侧颞下颌关节盘，将周围关节囊组织修剪干净后，用生理盐水彻底冲洗备用。

1.3 生物力学测试

1.3.1 试样制备 根据文献［11］中关节盘的五分区方法，将关节盘分为前、中、后、内、外带，每个区带大小均为关节盘的五分之一，并在前、中、后带中央按冠状方向用取样工具冲子（直径3 mm）制作圆柱状压缩试样，每带取4个试样放入4 ℃冰箱中备用。

1.3.2 预处理 实验前将试样从4 ℃冰箱中取出，用数显卡尺测出每个试样的厚度值，在微力试验机上输入基本参数（样品厚度和直径）。打开Bluehill 3软件，设置预处理压缩速度为0.025 mm·s-1，结束条件为最大载荷小于4.9 N，压缩位移小于1.5 mm［11-12］。压缩过程中，将试样置于一次性培养皿中，并滴注少量PBS液保持试样湿润，手动调节压头，压头与试样无限接近时，开始预压缩处理，循环3次即可。

1.3.3 压缩实验 在预处理的基础上设置实验方法和实验参数，实验载荷从零缓慢增加至其最大值（小于4.9 N，传感器精度为5 N），利用Bluehill 3软件计算出试样的弹性模量值、压缩应变在10%和20%时的压缩应力、载荷、时间、位移等参数［12-14］，获取各区带的应力应变的关系图。

1.4 扫描电子显微镜和偏振光显微镜观察

关节盘组织按不同分区制备成约2 mm大小的样品，每个分区各4个样品。在4%戊二醛中浸泡24 h，常规梯度乙醇脱水，冷冻干燥机中干燥8 h，真空喷金，在扫描电子显微镜（S-3400N型，Hitachi公司，日本）下观察关节盘不同分区的表面和断面超微结构。根据试样分区，利用冰冻切片机（CM1100型，LEICA公司，德国）将关节盘试样按水平面和冠状面切成20 μm厚的切片，在偏振光显微镜（BX51型，Olympus公司，日本）下观察关节盘内部不同区带的胶原纤维走向。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。单因素方差分析（ANOVA）和LSD-t检验比较关节盘前、中、后带的弹性模量的差异，选取α值为0.05。

2 结果

2.1 关节盘不同区间压缩应力与应变的关系

从关节盘前、中、后带的应力应变曲线图（图1）可见，各带的曲线图走形基本一致，坡脚区（toeregion）出现在压缩应变的10%以内，即关节盘组织的生理应变范围在10%以内。压缩应变达到10%以后，曲线变陡直，应力随应变明显增加。各区带的坡脚区略有不同，中间带的坡脚区相对较小。

2.2 关节盘不同区间压缩应力与应变的理论分析

根据拟线性黏弹性理论，关节盘各区带的应力应变值可以用多项式y=ax+bx2+cx3作为拟线性本构方程，得到拟合后的实验曲线。此本构方程可以为颞下颌关节盘组织工程提供原始力学性能参考。

图 1 关节盘各带的应力-应变曲线图Fig 1 Stress-strain curve of articular disc of each band

2.3 关节盘不同区间弹性模量的比较

山羊关节盘前、中、后带的弹性模量分别为（2.21±0.14）、（2.47±0.11）、（2.25±0.19） MPa。统计分析表明，关节盘中间带的弹性模量值最大，其与前带和后带均具有统计学差异（P=0.002，P= 0.018），前带与后带间无统计学差异（P=0.361）。

2.4 扫描电子显微镜和偏振光显微镜分析

关节盘各带的扫描电子显微镜和偏振光显微镜分析见图2和图3。

图 2 关节盘各带的表面和切面 扫描电子显微镜 × 1 000Fig 2 Articular disc surface and cut surface of each band scanning electron microscope × 1 000

图 3 关节盘各带的表面和切面 偏振光显微镜 × 200Fig 3 Articular disc surface and cut surface of each band polarized light microscope × 200

扫描电子显微镜（图2）可见，关节盘表面均匀覆盖着凝胶样物质，纤维粗细从几微米到几十微米不等。水平面扫描显示，前带和后带的纤维大致平行排列呈波纹或沟纹状结构，而中间带的胶原纤维束则排列致密，呈条索状，关节盘内外侧的胶原纤维束呈网纹状排列，外侧较内侧粗。切面扫描显示，前、后、内、外带纤维方向不完全单一而呈现参差不齐的纤维断面，中间带则呈现出鱼鳞状的纤维束断面。偏振光显微镜图（图3）可见，在山羊颞下颌关节盘内部，其周围区域纤维呈环形包绕而在中间带区域呈前后向排列，前带和后带区域的纤维主要呈内外走向并伴有前后方向的分支纤维，内侧和外侧的纤维以前后走向为主，夹杂有上下和内外向的分支纤维。综合分析，颞下颌关节盘内部呈现环形胶原网状结构。

3 讨论

弹性模量是表征在弹性限度内物质材料抗压或抗拉的物理量，其大小标志了材料的刚性，模量越大，越不容易发生形变［15］。本实验显示，山羊关节盘中间带的弹性模量大于前带和后带，说明中间带的刚性最大，抵抗压缩或外界冲击力的性能也最好。扫描电子显微镜和偏振光显微镜观察显示，中间带以致密的前后向胶原纤维为主，与其他区域的三维网状结构有所不同。

根据关节软骨二相理论，颞下颌关节盘是由黏弹性固体基质（胶原和蛋白多糖）和自由流动的间隙液组成的二相混合物，在生物力学性能方面具有弹性和黏弹性。本研究结果表明，关节盘在承受较小的应力应变范围（10%）内，发生的弹性形变可以恢复到原来的状态，这一区域即为组织的生理应变区，在应力应变图上显示为坡脚区。但当超过应变的10%，组织的刚性随着应变的变化迅速增加，反映了组织通过对刚度的调节来适应外界条件的变化。本实验结合拟线性黏弹性理论，采用多项式对不同区带的应力应变曲线进行理论拟合，获得了多项式方程y=ax+bx2+cx3，这为今后组织工程化颞下颌关节盘的研究提供了方法和实验依据。

本实验按不同分区取样进行了扫描电子显微镜和偏振光显微镜的观察，结果发现，山羊颞下颌关节盘中间带纤维呈前后走向的致密板层状结构，前带和后带的纤维一般为内外向并穿插有前后向和上下向的细小纤维束。组织的抗压缩性能与其内的组织液含量有很大关系，山羊关节盘中间带的板层样结构对外界的冲击压力有一定的对抗和缓冲作用，这与其他学者［16］对猪颞下颌关节盘内的生物力学功能的研究结果接近。此外，关节盘的抗压缩性能除了与其内的液体含量、胶原纤维分布和走向有关外，可能还与关节盘不同区带间富含的蛋白多糖和糖胺多糖的含量有关。对猪关节盘不同区带的定量生化研究显示，中间带含有最多的胶原蛋白和糖胺多糖［16］，这可能也是关节盘中间带弹性模量高的原因之一。

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（本文编辑 李彩）

［中图分类号］R 322.4+1

［文献标志码］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.015

［收稿日期］2015-07-24； ［修回日期］ 2015-10-27

［基金项目］国家自然科学基金（81160139）

［作者简介］李燕梅，硕士，E-mail：ymli13@lzu.edu.cn

［通信作者］康宏，教授，博士，E-mail：Kanghong@lzu.edu.cn

Collagen structure and biomechanical properties of the goat temporomandibular joint disc

Li Yanmei1， Bao Guangjie1，2，Zhong Ni1， Lü Wei1， Zhang Wenxia1， Wang Lanlan3， Kang Hong1.
（1. Institute of Stomatology， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China； 2. Key Lab of Stomatology of State Ethnic Affairs Commission， Northwest University for Nationalities， Lanzhou 730030， China； 3. School of Life Science， Lanzhou University， Lanzhou730000， China）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China （81160139）. Correspondence: Kang Hong， E-mail: Kanghong@lzu.edu.cn.

［Abstract］Objective To establish objectively biomechanical criteria for temporomandibular joint disc tissue engineerings. Methods Eight temporomandibular joint discs from a four-month-old goat were separated completely. A cylindrical sample with diameter of 3 mm in the anterior， intermediate， and posterior bands was obtained， and the samples underwent pre-compression test with three cycles under a speed of 0.025 mm·s-1. With the end condition for the maximum load of less than 4.9 N and 1.5 mm compression displacement， the formal compression test was performed with the same speed. Moreover， this test obtained the stress-strain relationship and elastic modulus of each disc band. Ultrastructure and collagen fiber orientation of the district zone were observed by scanning electron microscope and polarized light microscope. Results 1） The physiological strain range of an articular disc was within 10%， and the quasilinear constitutive equation of articular disc tissues can be fitted with the polynomial function: y=ax+bx2+cx3. 2） The elastic modulus of the intermediate disc zone was the largest （P＜0.05）. No significant difference existed between the anterior and posterior bands （P=0.361）. 3） Scanning electron microscope and polarized light microscope showed an annular disc collagen network structure， which was the internal part of the goat temporomandibular joint disc. The collagen arrangement of intermediate bands was tensely arranged anterior-posteriorly. The collagen of anterior and posterior bands went through mediolaterally with intersection of anterior-posterior branch fibersd. Conclusion Annular collagen network structure is the basis for goat temporomandibular joint disc compression resistance properties. The intermediate band demonstrated higher compression resistance performance than the anterior and posterior bands.

［Key words］temporomandibular joint disc； quasi linear constitution equation； compressive testing； elastic modulus； scanning electron microscope； polarized light microscope