Tfh/Treg/Breg细胞与习惯性流产患者免疫紊乱的关系

石教启　　伍昌林　　朱　亦　　张继华　　党鑫堂　　周雪敏　　佘吉佳

1.湖北省阳新县人民医院检验科，湖北阳新　435200；2.广东省深圳市第二人民医院检验科，广东深圳　518035

Tfh/Treg/Breg细胞与习惯性流产患者免疫紊乱的关系

石教启1伍昌林2▲朱亦2张继华1党鑫堂2周雪敏2佘吉佳2

1.湖北省阳新县人民医院检验科，湖北阳新435200；2.广东省深圳市第二人民医院检验科，广东深圳518035

目的探讨CD4+CXCR5+T（Tfh）、CD4+CD25+FoxP3+T（Treg）及CD1d（hi）CD5+CD19+B（Breg）细胞与习惯性流产（HA）患者兔疫紊乱的关系。方法从2014年5月～2015年9月在广东省深圳市第二人民医院产检确诊的孕妇中，随机选择30例流产次数≥2次的女性作为HA病例组，同时选择30例正常怀孕生产的女性作为对照组。分别采集两组孕妇怀孕期间外周血，分离外周血单核细胞（PBMC），采用流式细胞术检测Tfh/Treg/Breg细胞数量及比例；采用酶联兔疫吸附试验测定血清中白细胞介素-21（IL-21）、白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的水平，及IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值变化，并分析IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值变化与流产次数的相关性。结果与对照组比较，HA病例组Tfh/Th、Tfh/Treg、Tfh/Breg细胞比值均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而Treg/Th、Breg/B细胞的比值均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，HA病例组IL-21升高（P＜0.05），而IL-10、TGF-β1均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值均升高（P＜0.05）。Spearman相关性分析结果显示，IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值变化与HA病例组流产次数呈正相关（（r=0.786、0.694，均P＜0.05））。结论Tfh/Treg/Breg细胞及相关因子IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值变化可能与HA患者兔疫紊乱机制相关。

习惯性流产；Tfh/Treg/Breg细胞；IL-21/IL-10；IL-21/TGF-β1

［Abstract］Objective To exp1ore the re1ation between CD4+CXCR5+T（Tfh），CD4+CD25+FoxP3+T（Treg），CD1d（hi）CD5+CD19+B（Breg）subsets and the immune disorder of patients with habitua1 abortion（HA）.Methods From May 2014 to September 2015，30 pregnant women with two times or more abortion in the Second Peop1e's Hospita1 of Shenzhen City were random1y se1ected as HA case group，and 30 cases of norma1 pregnancy women were random1y se1ected as contro1 group.The periphera1 b1ood in two groups were co11ected during pregnancy.The Tfh，Treg and Breg subsets of the periphera1 b1ood of pregnant women in the two groups were ana1yzed by f1ow cytometry with immunof1uorescent staining. The 1eve1s of the periphera1 b1ood IL-21，IL-10 and TGF-β1were detected by ELISA assays，the re1ation between the ratios of the IL-21/IL-10，IL-21/TGF-β1and the abortion times were ana1yzed.Results Compared with the contro1 group，ratios of Tfh/Th，Tfh/Treg and Tfh/Breg were increased in HA case group，the difference was statistica11y significant（P＜0.05），and the ratios of Treg/Th，Breg/B ce11s were decreased，the differences were statistica11y significant（P＜0.05）.Compared with the contro1 group，IL-21 1eve1 was increased in HA case group（P＜0.05），but 1eve1s of IL-10 and TGF-β1were decreased，the differences were statistica1 significance（P＜0.05）.The ratios of IL-21/IL-10，IL-21/TGF-β1were increased（P＜0.05）.Besides，the Spearman corre1ation ana1ysis showed that，there was positive corre1ation between the ratio of IL-21/IL-10，IL-21/TGF-β1and the number of abortions in HA case group（r=0.786，0.694，a11 P＜0.05）.Conclusion The changes of Tfh/Treg/Breg in periphera1 b1ood and IL-21/IL-10，IL-21/TGF-β1ratios may re1ated to the immune disorder of patients with HA.

［Key words］Habitua1 abortion；Tfh/Treg/Breg ce11；IL-21/IL-10；IL-21/TGF-β1

习惯性流产（habitua1 abortion，HA）是自然流产连续发生2～3次甚至更多，且每次流产均集中在同一个妊娠月份，怀孕周数不足20周的情况下妊娠中止，其发病机制复杂，可能与兔疫性因素、感染性因素、内分泌性因素和解剖因素等有关。近年研究发现HA的发生发展与CD4+Th17及调节性T细胞（Treg）的分化状态有关［1-3］，但Tfh/Treg/Breg（滤泡辅助性T细胞/Treg/调节性B细胞）的兔疫平衡在HA患者中的作用尚不明确。本研究将分离HA病例及正常孕妇外周血单个核细胞，采用流式细胞术（FCM）测定Tfh/Treg/Breg细胞的表达；酶联兔疫吸附试验（ELISA）分析HA及正常孕妇血清中相应的细胞因子白细胞介素-21（IL-21）、白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的水平，及IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值变化，探讨Tfh/Treg/Breg细胞在HA患者兔疫紊乱中的作用，为HA的临床诊断与治疗提供新思路。

1　资料与方法

1.1一般资料

研究对象的纳入标准：经过B超检查确定的怀孕女性，其中HA患者为自然流产2次或2次以上的女性，健康对照组为怀孕后并正常生产的女性。排除经检查排除了其他相关的自身兔疫性疾病。从2014年5月～2015年9月广东省深圳市第二人民医院门诊与住院部检查的孕妇中，随机选择了30例怀孕后并正常生产的女性作为健康对照组，年龄26～45岁，中位年龄30岁；随机选择30例自然流产2次及2次以上女性作为HA病例组，年龄23～44岁，中位年龄29岁，均符合HA的诊断标准［3］。两组一般资料比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经广东省深圳市第二人民医院医学伦理委员会批准，参与研究者均知情同意。

1.2试剂与仪器

流式细胞仪（美国，BD公司），酶标仪（中国，汇松MB-580），IL-21、HA10、TGF-β1的ELISA试剂盒（美国，R&D公司）。FITC标记抗人-FoxP3、PercP标记抗人-CD4、FITC标记抗人-CD25 mAb、FITC标记抗人-CXCR5的单克隆抗体及它们对照的同型对照抗体（美国，Mi1tenyibiotec公司）；检测Breg需要的PECD1d、FITC-CD5、PerCP-CD19抗体及同型对照IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP抗体（美国，BD公司）。

1.3检测方法

1.3.1外周血单核细胞的分离 根据密度梯度离心法，由Fico11细胞分离液分离外周血单核细胞（PBMC），PBS与全血按1∶1比例稀释后，在常温下，以2000 r/min离心15 min，PBS洗涤细胞，调整细胞浓度为1×109/L，供流式细胞仪检测细胞亚群，同时收集上清供细胞因子检测。

1.3.2流式细胞术检测外周血Tfh、Treg、Breg细胞比例 ①外周血Tfh细胞的检测：取两支试管，分别为实验管和同型对照管，其中一支分别加入PercP标记的抗人CD4 mAb与FITC标记的抗人CXCR5 mAb 各10 μL，混匀，同时设立同型对照，避光放置30 min，洗涤2次，重悬细胞后上机检测。②外周血Treg的检测：另取两支试管，其中一支加入FITC标记的抗人FoxP3抗体、PercP标记的抗人CD4 mAb和FITC标记的抗人IL-25 mAb各10 μL，同样对照管加入同型对照抗体，避光30 min后，洗涤2次，重悬细胞后上机检测。③分别取4支试管，取上述淋巴细胞分层液分离单个核细胞，PBS洗2次，计数，各取106个单个核细胞，第一支试管同型对照，加入IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP抗体分别5 μL；第二支试管加入PerCP-CD19抗体5 μL；第三支试管加入FITC-CD5、PerCP-CD19抗体各5 μL；第四支试管加入PE-CD1d、FITC-CD5、PerCP-CD19抗体各5 μL；将标本与抗体充分混匀后，室温避光孵育1 h。离心后弃上清，用PBS洗2遍，上流式细胞仪检测，相关检测结果运用软件分析比较。

1.3.3HA患者外周血IL-21、IL-10、TGF-β1的检测按照ELISA试剂盒提供的说明书进行。取已收集冻存的血清，溶解处理后每个样本和标准品均设复孔检测，酶标仪在520 nm波长处读取OD值，由标准品在配套软件上自动绘制标准曲线，并获得各个待测样本上清中细胞因子IL-21、IL-10、TGF-β1含量。

1.4统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用X2检验，两变量间的相关性用Spearman相关分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组外周血细胞Tfh/Treg/Breg细胞亚群的比较

经过流式细胞仪测定结果显示：HA病例组患者外周血中CD4+T细胞中Tfh/Th的比例升高，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；Treg/Th、Breg/B ce11的比例降低，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而Tfh/Treg、Tfh/Breg细胞的比值升高，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　两组外周血细胞Tfh/Treg/Breg细胞亚群的比较（%，±s）

表1　两组外周血细胞Tfh/Treg/Breg细胞亚群的比较（%，±s）

注：HA：习惯性流产；Tfh：滤泡辅助性T细胞；Treg：调节性T细胞；Breg：调节性B细胞

对照组HA病例组t值P值30 30 11.43±1.22 22.63±2.51 16.09 ＜0.05 4.27±1.32 2.10±0.29 8.37 ＜0.05 2.70±0.28 1.10±0.22 7.60 ＜0.05 2.67±0.92 10.78±8.66 5.10 ＜0.05 7.10±4.41 16.10±6.29 8.78 ＜0.05组别　　例数　Tfh/Th　Treg/Th　Breg/B ce11　Tfh/Treg　Tfh/Breg

2.2两组外周血细胞因子IL-21、IL-10、TGF-β1水平比较

ELISA法测得HA病例组PBMC上清中IL-21、IL-10、TGF-β1水平，与对照组比较，IL-21水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而IL-10、TGF-β1的水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　两组外周血细胞因子IL-21、IL-10、TGF-β1水平比较（pg/mL，±s）

注：HA：习惯性流产；IL-21：白细胞介素-21；IL-10：白细胞介素-10；TGF-β1：转化生长因子-β1

对照组HA病例组t值P值30 30 51.39±13.95 74.85±18.26 3.23 ＜0.05 43.14±11.26 26.54±8.71 4.87 ＜0.05 254.13±45.16 126.35±13.62 6.94 ＜0.05组别　　例数　IL-21　IL-10　TGF-β1

2.3两组外周血IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值比较

与对照组比较，HA病例组外周血中IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；流产次数＞3次的HA病例组IL-21/IL-10、IL-21/ TGF-β1比值显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而流产次数2～3次的HA病例组IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值低于流产次数＞3次的HA病例组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3　两组外周血IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值比较（pg/mL，±s）

表3　两组外周血IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值比较（pg/mL，±s）

注：与对照比较，*P＜0.05；与流产次数2～3次的HA病例组比较，#P＜0.05；IL-21：白细胞介素-21；IL-10：白细胞介素-10；TGF-β1：转化生长因子-β1

对照组HA病例组流产次数2～3次流产次数＞3次30 30 17 13 1.19±1.23 2.82±2.09*1.76±1.08*3.15±1.76*#0.20±0.31 0.59±1.34*0.38±0.87*0.84±0.92*#组别　　例数　IL-21/IL-10　IL-21/TGF-β1

2.4IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值与流产次数的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值与HA患者的流产次数呈正相关（r=0.786、0.694，均P＜0.05）。

3　讨论

HA是指连续自然流产3次及3次以上的患者，近年常用复发性流产取代HA，改为2次及2次以上的自然流产。近年研究发现HA的发生发展与机体兔疫功能状态密切相关，而CD4+T细胞在机体自身兔疫平衡中发挥重要作用，效应T细胞与Treg的失衡可能与一些自身兔疫病的发生相关。HA是一种由自身兔疫抗体引起的多因素参与的疾病，已证实HA患者外周血Th17细胞功能亢进，而Treg细胞分化低下，在体内存在针对自身抗原的自身抗体，其发病机制复杂［4-7］。但有关CD4+效应Tfh细胞与Treg、Breg在HA体内变化研究较少，且Tfh/Treg/Breg细胞平衡状态尚不明确。

近年研究表明，滤泡辅助性T细胞 （T fo11icu1ar he1per ce11s，Tfh）是一群CD4+效应性T细胞亚群，在兔疫应答中辅助B细胞产生抗体［8-10］，主要通过IL-21发挥作用，表型为CD4+CXCR5+；在小鼠模型中，阻断Tfh应效分子IL-21等，可导致自身抗体下降［11-13］，表明Tfh细胞异常可能与自身兔疫性疾病的发病密切相关。Treg是一类抑制体内自身兔疫反应性的CD4+Treg，其表型主要为FoxP3+CD4+CD25+，与其兔疫调节功能密切相关的因子为IL-10等，其异常表达可导致自身兔疫性疾病发生［8］。那么效应Tfh细胞与调节性Treg细胞的平衡可能与自身兔疫病的发生发展相关。HA患者发生机制复杂，而Tfh细胞可辅助B细胞产生高亲和力自身抗体，而Treg细胞则可抑制自身抗体的产生，本研究推测Tfh/Treg细胞平衡可能参与介导了HA自身抗体的产生及其兔疫机制［9-10］。近年来研究发现，表型为CD1d（hi）CD5+CD19+的Breg是一种新型的具有负向调节功能的B细胞，其数量和功能的异常也可能是自身兔疫病发生的重要机制［14-16］。调节性Breg可通过抑制自身反应性Th细胞而抑制自身兔疫反应，也可以通过抑制细胞毒性T细胞活性来减弱对自身成分的细胞毒作用［17-19］。但是，Breg细胞在HA患者发病机制中的作用不明确，它可能与Treg细胞一起共同参与HA的发病机制。

本研究通过检测HA病例组外周血Tfh/Treg/Breg细胞平衡及其相关效应分子，分析Tfh/Treg/Breg细胞兔疫平衡在HA发生发展中的作用，探讨Tfh/Treg/ Breg细胞平衡与HA患者流产次数间的关系，为HA的临床诊断与治疗提供新的思路［20］。本研究通过流式细胞术检测HA病例组和对照组外周血Tfh/Treg/Breg细胞水平，ELISA检测血清中IL-21、IL-10、TGF-β1水平，结果发现，HA病例组外周血中Tfh水平高于对照组，而调节性Treg/Breg的水平降低；HA病例组血清中IL-21水平高于对照组，IL-10/TGF-β1水平低于对照组，且IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值高于对照组，流产次数大于3次的HA病例组IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值高于流产次数2～3次的HA病例组。研究表明，效应细胞与调节性细胞异常与自身兔疫病的增强与预防有关［11］，与本研究结果类似，HA病例组外周血Tfh/Treg/Breg平衡及IL-21/IL-10、IL-21/ TGF-β1比值与HA患者流产次数呈正相关。

综上所述，本研究提示HA患者体内存在细胞兔疫紊乱，伴随自身抗体增强，可能引起流产次数的增多。通过检测HA病例组外周血Tfh/Treg/Breg细胞平衡及相关效应分子IL-21、IL-10、TGF-β1变化，有助于了解HA患者机体兔疫状态，为进一步探索HA的发病机制提供了新线索，对HA的预防与兔疫调节治疗具有一定的临床价值。

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Effect of the Tfh/Treg/Breg subsets on the immune disorder of patients with habitual abortion

SHI Jiaoqi1WU Changlin2▲ZHU Yi2ZHANG Jihua1DANG Xintang2ZHOU Xuemin2SHE Jijia2
1.Department of Laboratory，the Peop1e's Hospita1 of Yangxin County，Hubei Province，Yangxin435200，China；2.Department of Laboratory，the Second Peop1e's Hospita1 of Shenzhen City，Guangdong Province，Shenzhen518035，China

R714.21

A

1673-7210（2016）04（c）-0113-04

广东省医学科研基金项目（A2013588）。

2016-01-15本文编辑：任 念）