表皮生长因子对化疗损伤小鼠骨髓基质细胞的保护作用

刁远明　　詹　瑧　　周　韬　　张伟伟　　张李唯　　董　伟　　张军峰

1.广州中医药大学基础医学院，广东广州　510006；2.南京中医药大学基础医学院，江苏南京　210023

表皮生长因子对化疗损伤小鼠骨髓基质细胞的保护作用

刁远明1，2詹瑧2▲周韬2张伟伟2张李唯2董伟2张军峰2

1.广州中医药大学基础医学院，广东广州510006；2.南京中医药大学基础医学院，江苏南京210023

目的探讨表皮生长因子（EGF）对5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗损伤小鼠骨髓基质细胞（OP9）的保护作用。 方法首先建立5-FU化疗损伤OP9细胞模型并摸索EGF作用剂量。然后，将实验分为空白对照组、模型组、实验组。用25 μg/mL 5-FU作用OP9细胞作为模型组，用20 ng/mL的EGF处理25 μg/mL 5-FU损伤的OP9细胞作为实验组，并设常规培养的OP9细胞作为空白对照组。分别用CCK-8法检测细胞存活率，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡，一氧化氮（NO）测试盒、一氧化氮合酶（NOS）测定试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒分别检测NO、iNOS、TNOS及Caspase-3的含量。结果与空白对照组比较，模型组细胞存活率明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，EGF可以显著保护5-FU损伤的OP9细胞，使其存活率升高（P＜0.01）。与空白对照组比较，模型组细胞早期凋亡率明显提高（P＜0.05），Caspase-3含量明显增加（P＜0.05），NO生成明显增多（P＜0.05），iNOS表达明显上升（P＜0.05）；与模型组比较，实验组化疗损伤OP9细胞的早期凋亡率显著降低（P＜0.05），Caspase-3含量明显下降（P＜0.05），iNOS的表达明显受到抑制（P＜0.01），NO的生成明显减少（P＜0.05）。结论EGF可能通过降低Caspase-3含量抑制细胞凋亡，减少NO的过度生成，发挥其细胞保护作用。

表皮生长因子；5-氟尿嘧啶；OP9细胞；化疗损伤

［Abstract］Objective To investigate the protective effect of epiderma1 growth factor（EGF）on 5-F1uorouraci1（5-FU）chemotherapy-injured mouse bone marrow stroma1 ce11s（OP9）.Methods First，the OP9 injury mode1 was estab1ished by using 5-FU and the effect of EGF on OP9 injury mode1 was exp1ored.Then，the experiment was divided into b1ank contro1 group，mode1 group and experimenta1 group.The OP9 ce11s treated with 25 μg/mL 5-FU were used as the mode1 group.The mode1 ce11s treated with 20 ng/mL EGF were used as the experimenta1 group，and the norma1 OP9 ce11s were used as b1ank contro1 group.CCK-8 assay was used to detect ce11 viabi1ity.Ce11 apoptosis was detected by FCM. NO，iNOS，TNOS，Caspase-3 were detected by nitric oxide（NO）test kit，nitric oxide synthase（NOS）assay kit，Caspase-3 active assay kit.Results Compared with the b1ank contro1 group，the ce11 surviva1 rate of mode1 group was significant1y decreased（P＜0.01），and compared with the mode1 group，EGF cou1d significant1y protect OP9 ce11s from 5-FU damage，and increased the surviva1 rate of ce11s（P＜0.01）.Compared with the b1ank contro1 group，the ear1y apoptosis rate of mode1 group was significant1y enhanced（P＜0.05），the content of Caspase-3 was significant1y increased（P＜0.05），the NO production was significant1y increased（P＜0.05），and the expression of iNOS was significant1y rose（P＜0.05）.Compared with the mode1 group，the ear1y apoptosis rate of injury OP9 ce11s of the experimenta1 group was significant1y decreased（P＜0.05），the content of Caspase-3 was significant1y reduced（P＜0.05），the iNOS expression was significant1y inhibited（P＜0.01），and NO generation was 1essened（P＜0.05）.Conclusion EGF might inhibit apoptosis through decreasing the content of Caspase-3 and reducing the excessive production of NO to p1ay its ro1e in ce11 protection.

［Key words］Epiderma1 growth factor；5-F1uorouraci1；OP9 ce11s；Chemotherapy injury

化疗是治疗恶性肿瘤的一种重要手段，其临床作用日益突出，但是肿瘤化疗的毒副作用以及对患者生活质量所造成的影响也成为影响其疗效的重要原因之一。化疗药物在快速杀灭肿瘤细胞的同时，对人体中处于活跃分裂状态的细胞也具有极大的杀伤力，这是其化疗毒副作用的根源。开发研究新的高效低毒药物、降低化疗毒副作用是当前的研究热点［1］。表皮生长因子（EGF）通过结合表皮生长因子受体（EGFR）刺激细胞发生有丝分裂，在胚胎发育、创伤修复、肿瘤发生等过程中起到重要作用［2-4］。另外，有研究表明，EGF可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖，是小鼠骨髓基质干细胞体外大量培养和快速增殖的有效刺激因子［5］。因此，笔者猜测EGF很可能对化疗药物损伤的机体的正常细胞有一定的保护作用。然而，EGF对肿瘤化疗药物损伤的小鼠骨髓基质细胞是否具有保护作用及其可能的作用机制目前尚未有相关研究报道，因此，本研究以EGF为主要研究对象，对其化疗辅助作用进行初步探讨。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株小鼠骨髓基质细胞（OP9），由中国科学院细胞库提供。

1.1.2试剂 胎牛血清（货号1428479，GIBCO公司）；MEMα培养基（货号12000022，GIBCO公司）；胰蛋白酶（GIBCO公司）；6孔和96孔细胞培养板（平底）（CORNING公司）；5-氟尿嘧啶 （5-FU，AMRESCO公司，批号0597）；EGF（PEPROTECH公司，纯度＞98%，批号0906390-1）；CCK8试剂盒 （日本同仁化学研究所，货号GC762）；Caspase-3活性检测试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术）；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒（eBioscience公司）；一氧化氮（NO）测试盒、一氧化氮合酶（NOS）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3仪器设备 酶标仪（Power Wave X340，美国BIOTEK公司）；超净工作台（苏净公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；显微镜（日本OLYMPUS）；荧光显微镜（BX41，日本OLYMPUS）；超纯水净化系统（南京易普易达科技发展有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（LS-B50L，上海华线医用核子仪器有限公司）；FACS Ca1ibur流式细胞仪（美国BD公司）；电子天平（德国sartorius）。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将细胞按1×105个/mL接种在培养瓶中，加入MEMα培养体系，二氧化碳培养箱温育（37℃、5%CO2），24 h后换液。细胞为梭型贴壁生长，待细胞生长至70%～80%时，用0.25%的胰酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.25-FU化疗损伤模型的建立 细胞以1×105个/孔密度接种于96孔板上，培养24 h后，加入5-FU使其终浓度为12.5、25、50、100、200 μg/mL，继续培养24、48 h，培养时间终止后，加入CCK8试剂10 μL，37℃反应2 h，450 nm波长检测各孔吸光度值（A）。按公式计算细胞存活率：存活率=［（A实验孔-A本底）/A空白对照组-A本底）］×100%。根据结果选定5-FU适宜的作用时间和损伤浓度。

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1.2.3CCK8法检测EGF对5-FU化疗损伤OP9细胞模型存活率的影响 细胞以1×105个/孔密度接种于96孔板上，24 h后，EGF组分别加入1.25、2.5、5、10、20 ng/mL的EGF及25 μg/mL 5-FU，模型组加入终浓度为25 μg/mL 5-FU，空白对照组始终用完全培养液，每组6孔。分别于药物作用24 h后加入CCK8试剂10 μL，同实验“1.2.2”项下操作并计算细胞存活率。实验重复3次。

1.2.4实验分组及给药实验分设空白对照组、模型组、实验组。模型组加入终浓度为25 μg/mL 5-FU，实验组加入20 ng/mL EGF溶液及终浓度为25 μg/mL 5-FU，空白对照组加入等量培养液。

1.2.5Anexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡 细胞接种于6孔板，按“1.2.4”的实验分组及给药，24 h后，胰酶消化收集细胞制备成的细胞悬液，1000 r/min离心5 min，离心半径为6 cm，弃上清，用PBS洗2次，再加入1 mL PBS重悬成单细胞悬液，按Anexin V-FITC/PI双染试剂盒操作，FCM分析细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.2.6Caspase-3试剂盒检测Caspase-3酶活性按“1.2.4”的实验分组及给药，24 h后，胰酶消化收集细胞制备成的细胞悬液，冰浴裂解细胞后，4℃高速离心，取上清液一部分按Caspase-3活性检测试剂盒相关步骤处理，测定各组样品中Caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度，通过pNA标准曲线可以计算出样品中催化产生的pNA的量。另取一部分上清液样品用Bradford法测定蛋白，通过蛋白标准曲线可以计算出每个样品中所含的蛋白的量。每个样品pNA的量比上样品中所含的蛋白的量即为单位重量蛋白中所含的Caspase-3的酶活力单位。实验重复3次。

1.2.7NO、NOS试剂盒检测NO和NOS含量 按“1.2.4”的实验分组及给药，24 h后，取细胞上清液，按NO测试盒相关步骤处理，测定各组NO变化情况。同时取细胞上清液，按NOS测定试剂盒相关步骤处理，测定各组NOS的活性变化情况。实验重复3次。

1.3统计学方法

应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两样本单因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.15-FU对OP9细胞存活率的影响

不同浓度5-FU处理OP9细胞后，细胞受到不同程度的损伤，与空白对照组比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1　5-FU对OP9细胞存活率的影响（±s，n=6）

表1　5-FU对OP9细胞存活率的影响（±s，n=6）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；5-FU：5-氟尿嘧啶

组别　5-FU终浓度（μg/mL）　24 h A450　　存活率（%）48 h A450　　存活率（%）空白对照组5-FU组0 12.5 25 50 100 200 0.5518±0.0087 0.4382±0.0118*0.4224±0.0107*0.4126±0.0127*0.3980±0.0071*0.3886±0.0112*100.00 78.98 76.55 74.67 72.13 70.43 0.5758±0.0141 0.4418±0.0052*0.4170±0.0090*0.4074±0.0087*0.4026±0.0132*0.3954±0.0150*100.00 76.72 72.42 70.75 69.92 68.67

考虑到5-FU对细胞损伤过多可能导致损伤难以修复，参考文献［6-8］，结合镜下所见细胞状态及后续预实验结果，本研究选用25 μg/mL 5-FU作用24 h作为造模条件。

2.2EGF对5-FU化疗损伤OP9细胞存活率的影响

不同浓度的EGF可以不同程度地保护5-FU化疗损伤的OP9细胞，使其存活率升高，其中10、20 ng/mL 的EGF与模型组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2　EGF对5-FU化疗损伤OP9细胞存活率的影响（±s，n=6）

表2　EGF对5-FU化疗损伤OP9细胞存活率的影响（±s，n=6）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；“-”表示无数据

组别　EGF浓度（μg/mL）　A450　　存活率（%）空白对照组模型组EGF组--1.25×10-32.5×10-35×10-31×10-22×10-20.8782±0.0266 0.6538±0.0256*0.6772±0.0113 0.6877±0.0197 0.6973±0.0364 0.7230±0.0315#0.7450±0.0285#100.00 74.44 77.11 78.30 79.40 82.32 84.83

2.3EGF对化疗损伤OP9细胞凋亡的影响

根据“2.2”实验结果，本研究进一步观察了20 ng/mL EGF对化疗损伤OP9细胞凋亡的影响，结果显示，与空白对照组比较，模型组细胞早期凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），EGF干预后，实验组细胞早期凋亡率较模型组明显降低（P＜0.05）。见图1。

图1　表皮生长因子对化疗损伤OP9细胞凋亡的影响

2.4EGF对化疗损伤OP9细胞的Caspase-3活性的影响

与空白对照组比较，模型组细胞Caspase-3含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），EGF干预后，实验组Caspase-3含量明显降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3　EGF对化疗损伤OP9细胞Caspase-3活性的影响（±s，n=3）

表3　EGF对化疗损伤OP9细胞Caspase-3活性的影响（±s，n=3）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；“-”表示无数据；EGF：表皮生长因子

组别　EGF浓度（ng/mL）　Caspase-3（酶活力单位）空白对照组模型组实验组--2 0 1009.00±56.57 1053.00±68.59*773.00±98.99#

2.5EGF对化疗损伤OP9细胞NO、NOS的影响

与空白对照组比较，模型组细胞上清液中NO含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），EGF干预后，实验组NO含量明显降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），iNOS呈现相同的变化趋势，而TNOS各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4　EGF对化疗损伤OP9细胞NO、NOS的影响（±s，n=3）

表4　EGF对化疗损伤OP9细胞NO、NOS的影响（±s，n=3）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；“-”表示无数据；EGF：表皮生长因子；NO：一氧化氮；NOS：一氧化氮合酶；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；TNOS：总一氧化氮合酶

组别　EGF浓度（ng/mL）NO （A550）NOS（A530）iNOS　TNOS空白对照组模型组实验组--2 0 0.0723±0.0005 0.0866±0.0055*0.0736±0.0035#0.1743±0.0102 0.2227±0.0261*0.1547±0.0037##0.2345±0.0332 0.2235±0.0289 0.2595±0.0728

3　讨论

骨髓基质细胞是成体骨髓中的一类多能干细胞，具有多向分化的潜能，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等［9-10］。骨髓基质干细胞的这种特性，使其处于一种活跃分裂状态，也常常成为化疗药物攻击的对象而被“误伤”。因此，本实验设计选用5-FU作为损伤骨髓基质细胞的化疗药物，模拟临床化疗损伤过程，首次摸索建立了5-FU损伤小鼠骨髓基质细胞的化疗损伤模型。研究结果显示，不同浓度5-FU处理OP9细胞后，细胞受到不同程度的损伤。

本研究首次观察了EGF对化疗损伤小鼠骨髓基质细胞是否具有保护作用。研究结果显示，不同浓度的EGF可以不同程度地保护5-FU化疗损伤的OP9细胞，使其存活率升高。细胞凋亡研究结果显示，EGF可显著降低化疗损伤OP9细胞早期凋亡率，结果提示EGF的保护作用与细胞凋亡途径有关。

对于NO与细胞凋亡，有学者［11］认为NO对不同细胞及同一种细胞的不同分化阶段的凋亡作用有异质性，在体内，NO促进还是抑制细胞凋亡取决于其浓度、氧化还原的环境及细胞内的保护机制。本研究结果显示5-FU刺激后促使骨髓基质细胞NO合成显著增多，且iNOS表达亦显著升高，NO的含量高低与iNOS表达水平相一致，与TNOS无明显相关性。因此，笔者认为5-FU刺激后骨髓基质细胞大量分泌NO促进细胞自身的凋亡，EGF作用后，主要通过抑制iNOS的表达来减少NO的过度生成，从而减少凋亡，发挥其细胞保护作用。

Caspase-3激活是细胞凋亡的标志分子事件，已成为细胞凋亡通路研究的经典指标［12-15］。本研究显示，EGF可以降低Caspase-3含量，提示其对化疗损伤的保护作用可能与降低Caspase-3含量相关。EGF保护化疗损伤OP9细胞的具体作用机制尚待进一步深入研究。

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Protective effect of epidermal growth factor on the chemotherapy-injured mouse bone marrow stromal cells

DIAO Yuanming1，2ZHAN Zhen2▲ZHOU Tao2ZHANG Weiwei2ZHANG Liwei2DONG Wei2ZHANG Junfeng2
1.Schoo1 of Basic Medica1 Science，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；2.Schoo1 of Basic Medica1 Science，Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Province，Nanjing 210023，China

R392.12

A

1673-7210（2016）04（c）-0008-04

国家自然科学基金资助项目（81473593、814734 58）；广东省高等学校优秀青年教师培养计划项目（YQ2015 042）。

刁远明，女，博士，副教授；研究方向：中西医结合基础、中医药基础研究。

2016-01-07本文编辑：张瑜杰）