半夏内生真菌所产β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究

陈 斌，钱 骅，闫淑珍，周林芳，赵伯涛*，黄晓德，朱羽尧

(1. 南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042； 2. 南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京 210009)



半夏内生真菌所产β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究

陈 斌1，钱 骅1，闫淑珍2，周林芳2，赵伯涛1*，黄晓德1，朱羽尧1

(1. 南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042； 2. 南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京 210009)

摘要从半夏中分离筛选得到一株植物内生真菌，提取培养液中的β-葡萄糖苷酶，研究其酶学特性。结果表明：该菌种所产β-葡萄糖苷酶的最适反应温度在45～50 ℃之间，最适pH 在7～8之间；在低于40 ℃条件下，pH 为6～9 时，酶活较稳定；其最适反应时间为40 min，金属离子和有机溶剂对酶活性影响都很大，在最适反应条件下其酶活为(77.83±0.42) U/mL。

关键词半夏；内生真菌；β-葡萄糖苷酶；酶学特性

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，也是纤维素酶复合酶系发挥协同作的关键酶。自从1837 年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶，人们探索β-葡萄糖苷酶的脚步就从来没有停止过[1-2]。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的一个重要组成部分，在医疗、食品、生物质转化中有重要的应用价值。研究发现，β-葡萄糖苷酶存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内[3-4]。对β-葡萄糖苷酶的研究已经成为热点，已由过去的研究从大豆、蚕豆、茶叶、香菇、微生物等材料中简单提取β-葡萄糖苷酶到现在微生物的培养条件优化、酶基因的克隆[5-10]以及粗酶液的纯化，但离β-葡萄糖苷酶的产品市场化还有一段距离。所以培养微生物，并从培养基或微生物中提取β-葡萄糖苷酶依然是解决β-葡萄糖苷酶来源的主要途径。

1材料、试剂与仪器

1.1材料

丝状植物内生真菌(南京师范大学微生物所闫淑珍老师分离提供)。

1.2试剂

3,5-二硝基水杨酸、乙酸、乙酸钠、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠等(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3仪器

高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；JA3103N电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；旋转蒸发仪RE-52A(上海亚荣生化仪器厂)；752紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；20PR-520型高速冷冻离心机(日本日立公司)；电热恒温水浴锅(江苏南通竹行电热恒温器厂)；低速沉淀离心机(北京医用离心机厂)。

2实验方法

2.1β-葡萄糖苷酶的提取

2.1.1盐析

本实验采用在搅拌条件下，缓慢地向对数期种子液中加入硫酸铵粉末至35%饱和度，静置过夜，离心分离(8 000 r/min，20 min)，弃去沉淀；再向上清液中加入硫酸铵粉末至80%饱和度，搅拌均匀后静置过夜，离心分离(8 000 r/min，20 min)，收集沉淀。

2.1.2透析脱盐

将经由盐析收集到的沉淀用少量磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲液溶解，放入透析袋中透析，4 ℃条件下，定时更换缓冲液直至无硫酸根离子。

2.2酶学特性研究

2.2.1酶活性测定

采用DNS 法测定酶反应产物—还原糖。取0.5 mL粗酶液加入1.5 mL缓冲液配置的0.5%的水杨酸苷溶液，放入50 ℃水浴锅中作用15 min，加入1.5 mL DNS，沸水浴5 min，冷却至室温后用蒸馏水稀释至20 mL，在波长540nm 处比色，记录吸光度(OD 540 nm)。活力定义为每1小时 产生1μg 还原糖所需的酶量为一个β-葡萄糖苷酶活力单位，用U表示。配制不同浓度的葡萄糖标准溶液，采用DNS法显色后测定吸光度，绘制标准曲线。

2.2.2酶的最适反应温度及热稳定性

在25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃和70 ℃的不同温度下，按上述测定酶活力方法，确定温度对酶活力的影响，然后酶在4 ℃和上述各温度下各保温10 h 后，在最适反应温度下测酶活，确定其热稳定性。

2.2.3酶的最适pH及pH稳定性

用pH 值为3～12 的缓冲液配制水杨苷溶液，按上述酶活测定方法，确定最适pH；又以不同pH 缓冲液1.50 mL 中加0.50 mL粗酶液，在最适温度下保温10 h后，最适温度下测酶活，以自然状态下的酶活为100%。

2.2.4反应时间对酶活性的影响

在最适温度，最适pH下，分别测反应时间为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 min和60 min，按上述酶活测定方法测定不同的酶活力。

2.2.5金属离子对酶活性的影响

配制各种金属离子浓度为200 mmol/L，使其反应终浓度为40 mmol/L， 在最适温度下保温10 h 后，按上述方法测定酶活，以未添加金属离子的酶活为100%。

2.2.6有机溶剂对酶活性的影响

在酶用量和底物浓度均相同的反应体系中,添加不同的有机溶剂， 使其终浓度为10%、20%、30%、40%、50%和60%，并以未添加有机溶剂为空白对照，在最适温度，最适pH下按上述方法测定酶活。

3实验结果

3.1酶活力测定

采用DNS 法测定酶反应产物—还原糖。绘制葡萄糖标准曲线其线性回归方程为y=0.013 1x-0.014 7，线性范围20～100μg/mL，R2=0.999 3。该粗酶液的活力为(77.83±0.42)U/mL。

3.2酶学特性研究

3.2.1酶的最适反应温度及热稳定性

该酶的最适反应温度在45～50 ℃之间，当温度超过60 ℃时，酶活力迅速下降，而当温度低于最适温度时随温度的升高酶活力逐渐上升(见图1)。该酶在 5～40 ℃条件下储藏，其酶活较稳定(见图2)，提示该酶可以在常温下储藏。

图1　温度对酶活力的影响

图2　酶的热稳定性

3.2.2酶的最适pH及pH稳定性

该β-葡萄糖苷酶的最适pH在7～8 之间， pH 超过8时， 相对酶活明显下降；pH 为6～9 时，β-葡萄糖苷酶的活力较高，达70%以上(见图3)。该酶的pH稳定性较差，在pH小于5和大于11的条件下酶活力均下降超50%(见图4)。

图3　pH对酶活力的影响

图4　酶的pH稳定性

3.2.3反应时间对酶活性的影响

该酶反应时间40 min时酶活力达到最大值。反应时间少于40 min，随着反应时间的增加，酶活力逐渐增加。反应时间多于40 min，随着反应时间的增加酶活力维持在最大活力的97%左右(见图5)。

3.2.4金属离子对酶活性的影响

以未添加金属离子的酶活为100%，0.001mg/mL的Zn2+、Fe2+、Sn2+、Mn2+、Cu2+和Ba2+均可使该酶的活力提高50%以上，其中Ba2+可使酶活力提高300%； Al3+、K+和Cr3+会使该酶的活力损失50%以上，其中Al3+使该酶活力的损失达70%以上(见图6)。

图5　反应时间对酶活力的影响

图6　金属离子对酶活力的影响

3.2.5有机溶剂对酶活性的影响

以未添加有机溶剂的酶活为100%，各有机溶剂对该菌种所产的β- 葡萄糖苷酶的活性均具有明显的抑制作用，在体积分数为0%～60%范围内随着浓度的升高，酶活性也呈下降趋势。当体积分数达到60%时乙酸乙酯、甲醇可使酶活力损失近50%，乙醇、乙腈、丙酮使酶活力损失超过60%(见图7)。

图7　有机溶剂对酶活力的影响

4结论

目前已知的菌种产β-葡萄糖苷酶的酶活普遍偏低，若利用基因工程技术对这些菌种进行分子改造则耗时耗力且耗资。所以最直接、有效的方法就是直接从自然界中筛选出产β-葡萄糖苷酶的酶活较高的菌种。本文从半夏植株中分离获得高产β- 葡萄糖苷酶植物内生真菌，提取发酵液中的β-葡萄糖苷酶制成粗酶液，并研究其酶学特性，为该酶的产业化应用打下基础。该菌株最大特点是产酶时间短，且所产酶：可以常温保存，具有很好的热稳定性；pH 作用范围6～9，较广泛；在实际应用中具有很大的优越性。

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doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.02.004

收稿日期：2015-08-12

基金项目：国家科技支撑项目(2011BAD33B03)。

作者简介：陈斌(1986—)，男，研究实习员，主要从事植物资源与化学的研究。E-mail: njcb3391@sina.com *通讯作者：赵伯涛(1962—)，男，研究员，主要从事植物资源与化学的研究。E-mail:zbt_nj@163.com

中图分类号：Q55

文献标识码：A

文章编号：1006-9690(2016)-02-0007-03

Enzyme Properties of β-Glucosidase of Endophytic Fungi Isolated fromPinelliaternata

Chen Bin1, Qian Hua1,Yan Suzhen2, Zhou Linfang2, Zhao Botao1, Huang Xiaode1, Zhu Yuyao1

(1. Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042,China;2. College of Life Sciences, Nanjing Normal University，Nanjing 210009,China)

AbstractAfter separation and selection from Pinellia ternata , we obtained a strain production of β-glucosidase. Some properties of β-glucosidase produced by this strain have been analyzed. Results showed the optimal activity temperature is between 45℃-50℃ and the optimum pH for reaction is 7-8. Besides, the β-glucosidase enzyme activity was relatively stable at pH 6-9 below 40 ℃ for around 40 min. Metal ion and organic solvent would influence the β-glucosidase enzyme activity a lot and the β-glucosidase enzyme activity was up to 77.83±0.42 U/mL under the optimum reaction conditions.

Key wordsPinellia ternata；endophytic fungi; β-glucosidase；enzymatic properties