实时荧光定量PCR检测血清miR-7方法的建立及临床初步应用

陈　鑫，韩　霜，臧素纲，杨萍灿，汪晓莺，周玉贵*

(1.南通大学附属东台医院 检验科,江苏 东台224200;2.南通大学医学院 免疫教研室，江苏 南通226001)



实时荧光定量PCR检测血清miR-7方法的建立及临床初步应用

陈鑫1，韩霜1，臧素纲1，杨萍灿1，汪晓莺2，周玉贵1*

(1.南通大学附属东台医院 检验科,江苏 东台224200;2.南通大学医学院 免疫教研室，江苏 南通226001)

摘要：目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green I 实时荧光定量PCR方法检测血清miR-7，并作临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-7 ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA，进行SYBR Green I实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线，绝对定量血清中miR-7的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-7表达水平，熔解曲线呈单峰，PCR扩增产物特异，在103copies/uL至106copies/uL范围内有良好的线性关系(r2=0.995)，并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-7表达水平明显高于健康体检者(P<0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green I 实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测血清中miR-7的表达水平，为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。

关键词：SYBR Green I实时荧光定量PCR；miR-7；糖尿病

(Chin J Lab Diagn,2016,20:0959)

microRNAs(miRNAs)是近年来研究发现的一类分布广泛的小分子RNA。它们基于与靶mRNA的序列互补配对结合，可以降解靶mRNA或抑制蛋白质翻译。作为一种新型基因表达调控因子，miRNAs参与生命过程中一系列的重要生物学进程，包括个体发育、器官形成、干细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡等[1-3]。随着研究的不断深入，miRNAs与疾病之间的关系也趋于明朗化，已成为目前临床应用研究的热点内容。有报道表明，miR-7是胰岛组织内表达最丰富的内分泌miRNA[4]，参与胰岛的发育和胰岛素合成，提示其在糖尿病的发病机制中可能扮演重要角色。因此，血清miR-7表达水平的检测是其临床应用研究首当其冲需解决的问题。

据此，本研究建立了ploy(A)聚合酶加尾的SYBRGreenI实时荧光定量PCR的检测方法。应用此种方法检测血清标本中miR-7的表达水平，初步探索是否能将miR-7作为糖尿病诊断的新型生物学标志物。

1材料与方法

1.1研究对象收集2012年6月至2013年6月南通大学附属东台医院糖尿病患者118例，其中男59例，女59例，年龄26-88岁，均经WHO(1999年)糖尿病诊断标准确诊，病程数月到数年不等。同期健康体检者106例作为对照组，其中男52例，女54例，年龄28-84岁。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2样本采集所有研究对象于清晨空腹采集静脉血3-5ml。分离血清后分装至-80℃恒温冰箱保存。

1.3主要试剂与仪器Trizol溶解试剂、dNTP混合物、逆转录酶、逆转录缓冲液、TaqDNA聚合酶、内含SYBRGreenI荧光染料的PCR缓冲液、焦炭酸二乙酯(DEPC)、TAE缓冲液、溴化乙锭(EB)、离心管(南通碧云天技术研究所)，无水乙醇、氯仿、异丙醇(无锡展望化工试剂有限公司)，100bpDNALadderMarker(大连宝生物工程有限公司)。RotorGeneQ实时荧光定量PCR分析仪(德国QIAGEN公司)、HC-2518R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)、SMA1000微量紫外分光光度计(北京美林恒通公司)、DYY-III8A型稳压稳流定时电泳仪(北京六一仪器厂)、DH-2000凝胶成像系统(北京华电公司)、BSC-1500ⅡA2X型生物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司)。

1.4引物设计和合成根据miRBASE(http://www.mirbase.org/)数据库中hsa-miR-7(UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU)的序列，设计其特异性poly(A)加尾逆转录引物和PCR扩增引物。线虫C.elegans-miR-39的模拟物、内参hsa-miR-15a及其引物均由德国QIAGEN公司设计合成(公司未予公开)。

1.5血清总RNA提取取200μL复溶的血清于离心管中，加入Trizol溶解试剂，充分混匀裂解；之后分别用氯仿、异丙醇及DEPC水配制的乙醇，并结合硅胶膜特异性吸附作用来分离和纯化RNA。RNA从离心管硅胶膜上洗脱溶于DEPC水中。通过测定计算RNA溶液260nm和280nm的紫外吸收值的比值(A260/A280)确认RNA浓度和纯度。

1.6逆转录反应反应体系体积为20μL，包括总RNA样本、dNTP混合物、逆转录酶、逆转录缓冲液、DEPC水。逆转录反应参数：37℃60min，95℃5min。逆转录反应获得的cDNA于-80 ℃保存。

1.7实时荧光定量PCR反应体系体积为20μL，包括miRNA逆转录产物cDNA、dNTP混合物、miR-7上游特异引物、下游通用引物、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液(内含SYBRGreenI荧光染料)、DEPC水。PCR反应循环参数：95℃预变性15min；94℃变性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，共40个循环。以同样的反应体系和hsa-miR-15a特异性引物进行内参hsa-miR-15a荧光定量。以DEPC水代替逆转录产物cDNA作为阴性对照。

1.8标准曲线的制作将人工合成的C.elegans-miR-39的miRNA模拟物以DEPC水稀释8个数量级，即101、102、103、104、105、106、107以及108copies/μL，分别取每一数量级稀释液2μl与待测标本同时进行逆转录以及PCR扩增检测，每反应设置3个复孔。扩增后根据扩增曲线设定统一阈值，然后根据标准品的浓度及每个浓度对应的CT平均值绘制标准曲线。根据此标准曲线及待测样本的CT值计算出该血清标本miR-7的绝对浓度，为绝对定量法。

1.9PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳配制2%的琼脂糖凝胶，加入溴化乙锭(EB)溶液至终浓度0.5μg/mL，80V恒压电泳40min，待溴酚蓝跑到2/3位置处停止电泳，紫外灯下观察产物的有无及大小。

2结果

2.1血清总RNA抽提及纯度检测的结果

经测量计算，所有标本提取RNA溶液的A260/A280比值(1.916±0.089)均在1.8-2.1范围内，表明RNA纯度较好，可以用于后续的实验。

2.2熔解曲线及PCR扩增产物电泳验证

如图1所示，熔解曲线呈单峰，未见杂峰信号，熔解温度约为77℃。表明逆转录PCR参数选择适当，产物特异性较好。poly(A)聚合酶加尾法逆转录PCR反应获得的PCR扩增产物的大小应约为85bp-87bp。PCR扩增产物经2%琼脂糖电泳，可见明亮、清晰的电泳条带，与预期大小一致，如图2所示。

2.3荧光定量PCR法的检测重复性试验

任取1份糖尿病患者血清标本的RNA抽提溶液，在1次荧光定量PCR中设置10个平行孔进行检测，计算批内变异系数(CV)。结果显示：miR-7的拷贝数为(111.49±3.99)×103copies/uL，批内CV为3.58%。对同1份标本进行连续10次荧光定量PCR的检测，计算批间变异系数(CV)。结果显示：miR-7的拷贝数为(107.94±5.71)×103copies/uL，批间CV为5.29%。

图1　实时荧光定量PCR熔解曲线

图2　逆转录PCR扩增产物的电泳图

2.4检测miR-7时标准品的扩增曲线及标准曲线

如图3所示，检测标准品C.elegans-miR-39模拟物的扩增曲线呈S型。在103copies/uL至106copies/uL的范围内CT值和标准品浓度呈良好线性关系，r2为0.995，制作成标准曲线如图4。

图3　103至106copies/uL4个浓度梯度标准品的扩增曲线

2.5miR-7在糖尿病患者及健康体检者血清中检测结果的比较

118例糖尿病患者和106例健康体检者的血清标本均可见扩增曲线，但表达程度不同，见图5。由表1可见，糖尿病患者和健康体检者血清中miR-7的表达水平分别为(21.01±12.90)×103copies/uL和(2.65±1.18)×103copies/uL，糖尿病患者血清miR-7的表达水平高于健康体检者。经Mann-whitneyU检验进行组间比较，两组之间的差异具有统计学意义(P=0.015)。

图4　检测标准曲线

图5　　　　部分糖尿病患者及健康体检者血清中miR-7荧光定量PCR扩增曲线

组别n平均Ct值平均拷贝数(103copies/uL)糖尿病患者11826.81±3.6221.01±12.90健康体检者10630.01±2.762.65±1.18

3讨论

miRNAs转录后的调节功能与多种疾病的病理生理过程有关，包括糖尿病。2008年，Bravo-Egana等人[4]通过对比miR-375在胰岛和腺泡组织的不同表达情况后，得出结论：miR-7是胰岛内表达最丰富的内分泌miRNAs。随后，miR-7参与调控胰岛β细胞分化发育，与血糖平衡调节有关的研究陆续被报道[5,6]。因此，miR-7有成为诊断糖尿病的新生物学标志物的潜质。

要将miRNAs作为疾病诊断的生物学标志物，需要建立标准且规范的提取方法和检测方法。近年来，miRNAs的检测技术得到了快速发展。对于新发现的miRNAs，克隆测序是首选的鉴定方法[7]。Northernblot是验证和确认miRNAs的经典方法，常用来评价其它的miRNAs检测方法的可靠性，但该方法繁琐且灵敏度较低，不适用于临床样本的高通量检测[8]。基因芯片技术可以实现快速、高通量检测[9]，但结果重复性差、准确度低，常用作初筛。而实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性好、操作流程简单、设备和试剂要求相对较低，因此便于普通临床实验室开展。

本研究采用poly(A)聚合酶加尾逆转录和SYBRGreenI荧光染料标记技术，建立了一种实时荧光定量PCR法检测血清中miR-7的表达水平。熔解曲线呈特异性单峰，扩增曲线呈典型S型，无引物二聚体和非特异性扩增产物的形成。PCR反应扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，也可见明亮、清晰的条带，且与预期大小基本一致，证明扩增产物的特异性较好。以人工合成的C.elegans-miR-39miRNA模拟物绘制标准曲线，为绝对定量法，这与目前实时荧光定量PCR使用较多的相对定量法[10,11]不同。标准品CT值与其浓度在103copies/uL至106copies/uL的范围内呈良好线性关系(r2=0.995)，反映该方法能准确地定量检测血清中miR-7的表达水平。通过批内和批间重复性实验分析可见：批内CV为3.58%，批间CV为5.29%，表明该检测方法具有较好的重复性。由此可见，所建立的检测方法可用于临床上检测血清中miR-7的表达水平。通过分析定量检测数据，我们发现：118例糖尿病患者血清中miR-7的表达水平明显高于106例健康体检者(P=0.015)，这一结果与之前的文献报道[5,6]吻合。

综上所述，本研究建立的ploy(A)聚合酶加尾的SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测血清miR-7是一种简便、灵敏度高、特异性强和稳定性好的方法，适合临床实验室广泛开展，为miR-7在糖尿病中临床应用价值的深入研究打下了基础。

参考文献：

[1]JohnstonRJ,HobertO:AmicroRNAcontrollingleft/rightneuronalasymmetryinCaenorhabditiselegans[J].Nature,2003,426(6968):845.

[2]BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction[J].Cell,2004,116(2):281.

[3]XuP,GuoM,HayBA:MicroRNAsandtheregulationofcelldeath[J].TrendsinGenetics,2004,20(12):617.

[4]Bravo-EganaV,RoseroS,MolanoRD,etal.QuantitativedifferentialexpressionanalysisrevealsmiR-7asmajorisletmicroRNA[J].BiochemBiophysResCommun,2008,366(04):922-926.

[5]WangY,LiuJ,LiuC,etal.MicroRNA-7regulatesthemTORpathwayandproliferationinadultpancreaticβ-Cells[J].Diabetes,2013,62(3):887.

[6]Domínguez-BendalaJ,KleinD,PastoriRL,etal.MicroRNA-7controlofβ-cellreplication[J].Diabetes,2013,62(3):694.

[7]HafnerM,LandgrafP,LudwigJ,etal.IdentificationofmicroRNAsandothersmallregulatoryRNAsusingcDNAlibrarysequencing[J].Methods,2008,44(1): 3.

[8]PallGS,HamiltonAJ.ImprovednorthernblotmethodforenhanceddetectionofsmallRNA[J].NatProtoc,2008,3(6): 1077.

[9]LiuCG,CalinGA,MeloonB,etal.Anoligonucleotidemicrochipforgenome-widemicroRNAprofilinginhumanandmousetissues[J].ProcNatlAcadSci,USA,2004,101(26): 9740.

[10]吕品,赵雪,贺付成等.血浆miR-328和miR-155在急性冠脉综合征诊断及鉴别诊断中的价值[J].临床检验杂志,2013,31(7):494.

[11]梁国威,宋燕,邵冬华,等.初诊2型糖尿病患者血清中miR-29a和miR-375表达 变化及其与糖、脂标志物相关性研究[J].中国实验诊断学,2013,17(3):475.

基金项目：江苏省盐城市医学科技发展计划项目(YK20130103)

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)06-0959-04

中图分类号：R587.1

文献标识码：A

作者简介：陈鑫，31岁，硕士，主管检验技师，主要从事免疫学及分子生物学方面的研究。

(收稿日期：2014-09-17)

Establishmentofareal-timefluorescencequantitativePCRmethodfordetectingmiR-7inserumanditsclinicalprimaryapplication

CHEN Xin,HAN Shuang,ZANG Su-gang,et al.

(Department of Clinical Laboratory,Dong-tai Hospital Affiliated Nantong University,Jiangsu Dongtai 224200,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method of SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)by poly(A)polymerase tailing for the determination of miR-7 in serum,and apply it primarily.MethodsTotal RNA was extracted from serum by Trizol reagent.miR-7 was reverse transcripted into cDNA by tailing poly(A)polymerase,and then the cDNA was amplified and detected by using SYBR Green I real-time FQ-PCR.Generate a standard curve of a dilution series of C.elegans-miR-39 mimic,and detect the expression level of miR-7 in serum quantitatively.ResultsThe method can quantitatively detect the expression level of miR-7 in serum.The melting curve showed a single peak,the PCR products was specific,a good linear relationship in the range of 103copies/uL to 106copies/uL (r2=0.995),and the detection was repeatable.The expression level of miR-7 in diabetic patients was significantly higher than those in healthy subjects (P<0.05).ConclusionThe method of SYBR Green I FQ-PCR by poly(A)polymerase tailing can detect the expression level of miR-7 sensitively and specifically in serum.It lays a methodological foundation for further study on clinical application.

Key words:SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR；miR-7；diabetes mellitus