促性腺激素释放激素激动剂对子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响

焦婷婷,刘玉杰,高　原,李　星,惠　宁

(第二军医大学附属长海医院 妇产科,上海200433)



促性腺激素释放激素激动剂对子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响

焦婷婷,刘玉杰,高原,李星,惠宁*

(第二军医大学附属长海医院 妇产科,上海200433)

摘要：目的研究促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-α)对子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响。方法体外原代培养人子宫内膜细胞并构建蜕膜化模型，用不同浓度的GnRH-α处理细胞，Real-Time PCR方法检测标志子宫内膜基质细胞蜕膜化程度的分子催乳素(prolactin,PRL)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1) mRNA的表达，ELISA法检测其在细胞上清液中的蛋白表达。结果10-8g/ml浓度，10-7g/ml浓度和10-6g/ml浓度的PRL mRNA表达均增加，10-7g/ml浓度和10-6g/ml IGFBP-1 mRNA的表达增加(P<0.05，P<0.01)；蜕膜化72 h 10-6g/ml浓度基质细胞上清液中PRL 蛋白增加，10-7g/ml浓度上清液中IGFBP-1蛋白增加(P<0.05)。结论GnRH-α促进了子宫内膜基质细胞蜕膜化PRL和IGFBP-1 mRNA的表达和上清液中PRL和IGFBP-1 蛋白的分泌。GnRH-α可以促进对人子宫内膜基质细胞的蜕膜化。

关键词：促性腺激素释放激素激动剂；子宫内膜基质细胞；蜕膜化；PRL；IGFBP-1

(ChinJLabDiagn,2016,20:0879)

子宫内膜蜕膜化是指子宫内膜在雌、孕激素的作用下由增殖期向分泌期转变的过程。子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)增殖，形态发生变化，从成纤维细胞转变为多核、胞质丰富的蜕膜化基质细胞(decidual stromal cells,DSCs)。孕激素是子宫内膜蜕膜化的始动因素，多种因素共同参与其中，包括细胞因子类、垂体激素、免疫细胞、信号转导分子等。其中催乳素(prolactin,PRL)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein1,IGFBP-1)可以作为衡量蜕膜化程度的标志分子[1-4]。蜕膜化是妊娠建立的重要步骤，对胚胎植入的过程起着关键作用。子宫内膜基质细胞如果不能形成有效的蜕膜化，会导致胚胎着床的失败。

促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-α)是将天然的促性腺激素结构中某些氨基酸进行置换，因此形成的化合物比天然的促性腺激素与垂体上GnRH受体结合的亲和力更强，半衰期延长，稳定性强。大剂量使用时可以对垂体分泌的FSH和LH起到降调节作用，因此广泛应用于IVF-FT技术的控制性促排卵长方案中，有研究发现GnRH-α不仅可以影响性腺激素的分泌，还可以直接作用于子宫内膜，提高胚胎移植的成功率。但是GnRH-α对子宫内膜基质细胞的蜕膜化有怎样的作用，国内外尚无报道，本实验通过研究GnRH-α对人子宫内膜基质细胞的蜕膜化的影响，探讨其在胚胎移植中的作用。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂人子宫内膜组织由长海医院生殖医学中心提供，DNA酶Ⅰ型购于美国Sigma公司，Ⅱ型胶原酶购于WASHINGTON公司，胎牛血清、DMEM 培养基均购于美国Gibcol公司，醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesteroneacetate,MPA)和8-Br-Camp均购于美国Sigma公司,PCR试剂盒购于美国Bio-med公司，ELISA试剂盒购于北京碧云天生物科技公司，Triporelin(曲普瑞林)购于德国辉凌制药公司。

1.2实验方法

1.2.1子宫内膜基质细胞的原代培养和蜕膜化模型的构建按差时贴壁法原代培养人子宫内膜基质细胞，取宫腔镜下刮取的少量人子宫内膜组织，冲洗标本，剪碎。将其置于F12 DMEM培养液配置的消化液中(DNA酶，终浓度为0.5 mg/ml；Ⅱ型胶原酶，终浓度为1.5 mg/ml；BSA，终浓度为1 mg/ml)，37℃，120-130转/分，摇动水浴消化40-60 min。收集上层液体，终止消化，600 rpm×3 min离心沉淀未消化完全的组织。收集上清液，以1 100 rpm×10 min离心沉淀细胞。弃上清液，重悬细胞沉淀，经400目(孔径38 μm)不锈钢细胞滤网过滤。将滤液接种25 cm细胞培养瓶中，置于37℃，5 % CO2培养箱中培养。贴壁30-40 min后，更换培养液以去除不贴壁的腺上皮细胞和血细胞(基质细胞在40 min内贴壁，腺上皮细胞贴壁时间大于30 min)。48 h后全量更换培养液，当细胞贴壁生长达到瓶底的70%-80%时进行传代。对P1代的子宫内膜基质细胞进行蜕膜化诱导，诱导方法为加入10-7M MPA和5×10-4M 8-Br-cAMP(M+A)，诱导72 h。

1.2.2Real-Time PCR方法检测标志子宫内膜基质细胞蜕膜化程度的分子PRL和IGFBP-1 mRNA的表达 对P1代的子宫内膜基质细胞按M+A法进行蜕膜化诱导，培养72 h后，按Trizol说明书的步骤提取基质细胞的总RNA，反转录成cDNA，稀释后按Real-Time PCR试剂盒方法进行PRL和IGFBP-1基因的扩增。跟据GeneBank检索人PRL和IGFBP-1的mRNA序列，应用Primer Premier5.0软件并参考相关文献，选取引物。PRL引物序列：上游：5＇-CAC TAC ATC CAT AAC CTC TC-3＇下游：5＇-ATG CTG ACT ATC AAG CTC AG-3＇，IGFBP1引物序列:上游：5＇-TAT GAT GGC TCG AAG GCT CTC-3＇,下游：5＇-GTA GAC GCA CCA GCA GAG TC-3＇。将合成的cDNA产物加入体系中进行PCR反应，分别扩增样本目的基因和管家基因β-actin，利用Ct值进行定量分析，检测mRNA表达量的变化。

1.2.3ELISA方法检测细胞上清液中PRL和IGFBP-1蛋白的分泌对P1代的子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化培养，按(M+A)法。分别于24、48和72 h收集细胞上清液，按ELISA试剂盒稀释标准品，留取的细胞上清液，4°C，1 000 r/min，离心20 min；依次加入样品和标准品，再加入所需的一抗，经孵育，洗涤后加二抗，37℃孵育1 h，用PBS洗涤3次，每次间隔2 min，分别加入ABC工作液，37°C孵育30 min，用PBS洗涤5次，每次间隔2 min，加入TMB显色，孵箱中孵育20-30 min，避光显色，加入终止液终止显色。用酶标仪检测450 nm测各孔OD值。

2结果

2.1原代子宫内膜基质细胞的培养及蜕膜化模型的构建对原代培养的人子宫内膜基质细胞P1代进行蜕膜化诱导，加入10-7M MPA和5×10-4M 8-Br-cAMP(M+A)。如图1所示：A图为原代培养的人子宫内膜基质细胞，细胞呈梭状，为分散型生长。B图为蜕膜化诱导72 h后的人子宫内膜基质细胞，细胞增大圆润，增殖明显，排列紧密。均在普通光学显微镜下100×下观察。

图1　子宫内膜基质细胞

2.2Real-Time PCR方法检测GnRH-α对子宫内膜基质细胞蜕膜化中PRL和IGFBP-1 mRNA的表达的影响原代培养的人子宫内膜基质细胞P1代进行蜕膜化诱导72 h，诱导同时加入不同浓度的GnRH-α(曲普瑞林)处理细胞。实验分为4组，①空白对照组；②10-8g/ml浓度组；③10-7g/ml浓度组；④10-6g/ml浓度组；用Real-time PCR方法检测蜕膜化中PRL和IGFBP1 mRNA的表达，结果如图2和图3所示:PRL mRNA随着GnRH-α浓度的升高而表达增加，在10-8g/ml浓度组和10-7g/ml浓度组差异具有统计学意义(*P<0.05 vs空白对照组)；在10-6g/ml浓度组差异显著(**P<0.01 vs 空白对照组)。IGFBP-1 mRNA在10-8g/ml浓度组表达降低，差异无统计学意义；在10-7g/ml浓度组表达增加，差异具有统计学意义(*P<0.05 vs 空白对照组)；在10-6g/ml浓度组差异显著(**P<0.01 vs 空白对照组)。

图2　　　　GnRH-α对子宫内膜基质细胞蜕膜化中PRL mRNA的表达的影响

图3　　　　GnRH-α对子宫内膜基质细胞蜕膜化中IGFBP-1mRNA的表达的影响

2.3ELISA方法检测GnRH-α对子宫内膜基质细胞蜕膜化上清液中PRL和IGFBP-1蛋白分泌的影响原代培养的人子宫内膜基质细胞P1代进行蜕膜化诱导，加入不同浓度的GnRH-α(曲普瑞林)处理细胞，分别在蜕膜化24、48和72 h收集细胞上清液，用ELISA方法检测上清液中PRL和IGFBP-1蛋白的分泌。实验分为3组，①空白对照组； ②10-7g/ml浓度组；③10-6g/ml浓度组；结果如图4和图5所示:10-6g/ml浓度组上清液中的PRL蛋白量在蜕膜化72 h较空白对照组增加(*P<0.05 vs 空白对照组)； 10-7g/ml浓度组上清液中的IGFBP-1蛋白量在蜕膜化72 h较空白对照组增加(*P<0.05 vs 空白对照组)。

图4　GnRH-α对子宫内膜基质细胞蜕膜化上清液中PRL蛋白表达的影响

图5　GnRH-α对子宫内膜基质细胞蜕膜化上清液中IGFBP-1蛋白表达的影响

3讨论

胚胎的种植通常发生在受精后的3-5天，进入宫腔的胚胎和子宫内膜按照一定的时间和空间顺序分泌相关蛋白和局部因子，达到相互识别，相互融合进而完成着床的过程。这其中包括子宫内膜蜕膜化，囊胚孵出后的定位、黏附和滋养层细胞的侵入，直至整个胚胎包埋在子宫内膜基质细胞中，临床上称这一时期的子宫内膜为“种植窗”期。胚胎这种严格的时空定位现象提示胚胎激活和子宫内膜对其接受性同步与否是其着床成功的关键因素，对于胚胎来说，种植的第一道关口就是子宫内膜的容受性，因此研究着床过程中子宫内膜的蜕膜化对于临床上辅助生殖技术中胚胎移植的成功具有重大的意义[5,6]。

目前的研究表明子宫内膜基质细胞的蜕膜化过程有多种细胞因子，多种因素共同参与。其中胞内信号转导第二信使的cAMP在蜕膜化中起着关键作用。cAMP可以与子宫内膜基质细胞表面相关受体结合,激活G蛋白信号通路，调节子宫内膜的蜕膜化。在人体外子宫内膜基质细胞的诱导中,cAMP能显著促进子宫内膜基质细胞合成分泌泌乳素(PRL),因此目前蜕膜化模型的建立多采用cAMP与醋酸甲羟孕酮的联合诱导[7]。本实验也是采用这一经典方法构建了人体外子宫内膜基质细胞蜕膜化模型。

GnRH-α的降调节作用目前广泛应用于子宫内膜异位症患者的治疗和IVF-ET技术控制性促排卵的长方案中。研究表明子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜蜕膜化程度降低，是导致不孕的因素之一[8-10]。临床上异位症患者在接受GnRH-α治疗后自然妊娠率增加，对于因不孕接受IVF-ET治疗的异位症患者选择长方案GnRH-α降调节后妊娠率较别的方案增加。这说明GnRH-α可能对异位症患者子宫内膜的蜕膜化具有一定的作用。另外多项研究表明在IVF-ET术中接受冻融胚胎移植的患者，人工周期使用GnRH-α进行预处理后，其临床妊娠率较对照组提高，胚胎停育和异位妊娠的发生率降低[11,12]。这提示我们GnRH-α有助于改善子宫内膜的容受性，提高妊娠率，利于胚胎的早期发育。那么GnRH-α是怎样作用于子宫内膜，有学者研究发现使用 GnRH-a预处理后影响了子宫内膜上胞饮突 的形成时间，与自然周期相比，胞饮突的形成时间平均提前 1 到2 天[13,14]，因此影响了子宫内膜种植窗的发生时间。

在本研究中，我们探讨了GnRH-a对子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响，发现GnRH-a可以促进子宫内膜基质细胞的蜕膜化，和上述结果都表明了GnRH-a能够直接作用于子宫内膜，影响其容受性。为GnRH-α用于治疗子宫内膜异位症引起的不孕症提供了的新理论支持，也为临床上研究GnRH-α在IVF-ET术胚胎移植中的作用提供了新的研究方向。GnRH-α通过怎样的机制调节子宫内膜基质细胞的蜕膜化仍需要我们进一步的研究。

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基金项目：上海市科委基金项目(09411966600)

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)06-0879-04

中图分类号：R392

文献标识码：A

(收稿日期：2015-12-17)

The roles of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRH-α) in the decidualization of endometrial stromal cells(ESCs)

JIAOTing-ting,LIUYu-jie,GAOYuan,etal.

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ChanghaiHospitalofSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo study the roles of gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRH-α) in the decidualization of endometrial stromal cells(ESCs).MethodsCulture primary human endometrial stromal cells,and build the decidualed human endometrial stromal cells model in vitro，treated with different concentrations of GnRH-α,Using Real-Time PCR to detect the the expression PRL(prolactin) and IGFBP-1 (insulin-like growth factor binding protein1) mRNA,which is the marker of decidualization,ELISA was also used to detect its expression in the cell supernatant ResultsIn 10-8g / ml concentration,10-7g / ml concentration and 10-6g /ml PRL mRNA expression increased,in 10-7g / ml concentration and 10-6g / ml IGFBP-1 mRNA expression increased(*P<0.05,**P<0.01);after decidualized for 72 hours，in 10-6g / ml concentration PRL protein increased in the cell supernatant，in 10-7g / ml concentration IGFBP-1 protein increased (*P<0.05).ConclusionGnRH-α increase the expression of PRL and IGFBP-1 mRNA in the the decidualization of ESCs.and also increase the PRL and IGFBP-1 protein expression in the cell supernatant.GnRH-α can promot the the decidualization of ESCs.

Key words:gonadotropin releasing hormone agonist;endometrial stromal cells;decidual;PRL;IGFBP-1