干细胞因子在严重烧伤大鼠肠组织中的表达

王永杰，严　珺，李　雷，尹　飞，卢日峰，郭　丽*

(1．吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，吉林 长春130021；2．吉林大学中日联谊医院 骨科，吉林 长春130033)



干细胞因子在严重烧伤大鼠肠组织中的表达

王永杰1，严珺1，李雷1，尹飞2，卢日峰1，郭丽1*

(1．吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，吉林 长春130021；2．吉林大学中日联谊医院 骨科，吉林 长春130033)

摘要：目的观察严重烧伤后不同时间大鼠小肠损伤情况以及干细胞因子(stem cell factor,SCF)在受损小肠组织的表达。方法Wistar雄性大鼠按照随机原则分为5组，烧伤前组、严重烧伤模型1天组、2天组、4天组和对照组，每组6只。制备严重烧伤模型后，每天观察并记录大鼠一般状态和体质量变化。HE染色观察大鼠小肠组织病理组织变化，免疫组织化学和蛋白印迹法检测SCF蛋白的表达。结果对照组体质量逐渐上升，而烧伤组大鼠体质量增长缓慢，至烧伤后2天和4天烧伤组体重显著低于对照组(P<0.05)。HE染色结果显示烧伤前小肠绒毛结构完整，排列整齐，细胞形态表现正常；烧伤组有不同程度损伤，如间质和固有层水肿，上皮细胞变性坏死，绒毛顶端囊状间隙甚至脱落，烧伤后2天最严重。免疫组织化学和Western blot结果都显示与烧伤前比较小肠组织烧伤后1天SCF表达减少，2天和4天有所回升(P<0.05)。结论严重烧伤可以导致大鼠小肠组织损伤，SCF在烧伤导致的大鼠肠道损伤中发挥着一定的作用。

关键词：烧伤；肠损伤；干细胞因子

(ChinJLabDiagn,2016,20:0875)

烧伤是一种由火焰、高温液体、放射线等因素导致的常见的外伤性疾病。我国将总烧伤面积30%以上以及烧伤深度三度且面积10%以上的定义为重度烧伤，这类烧伤会引起体液渗出和全身应激反应，治疗不当会引发休克危及生命。目前临床上以补充血容量，积极防治休克和继发性感染，合理营养为主，疗效欠佳。严重烧伤导致机体损伤的机制复杂，治疗困难，死亡率高。研究者现在普遍认为烧伤后血管内皮细胞受损，血管通透性增加，导致有效血容量下降，机体维持心脏和大脑等重要脏器的血供，外周组织血供减少，胃肠道的血供下降最为明显，损伤尤为严重[1]。干细胞因子在肠组织维持一定的浓度是保证胃肠道调控Cajal间质细胞生长发育，繁殖和功能维持的基础[2,3]。干细胞因子缺乏可能导致自主肠蠕动障碍[4]，肠道T细胞增殖能力减少，免疫功能降低[5]。有研究报道干细胞因子在肾毒性血清性肾炎组织中表达有所增长[6]，而增高干细胞因子的表达有助于脑缺血再灌注后行动能力恢复[7]，改善糖尿病大鼠膀胱组织损伤[8]。干细胞因子在烧伤肠组织不同时间的表达情况仍不清楚，其在烧伤肠组织损伤中的作用机制尚未见报道。

本研究拟定通过检测干细胞因子在严重烧伤大鼠小肠组织的表达，初步探讨烧伤后肠道组织损伤与干细胞因子之间的关系，为后期研究提供基础。

1材料与方法

1.1实验动物

雄性Wistar大鼠，体重在240-280 g，购于吉林大学实验动物中心。

1.2实验方法

1.2.1烧伤肠损伤动物模型建立将实验大鼠按照随机原则分为5组，烧伤前组，严重烧伤模型1天组、2天组、4天组和对照组(未做烧伤处理，跟踪体重和一般状态)，每组6只。用8%硫化钠脱去大鼠背部被毛，温水清洗干净。12 h禁食不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，烧伤组大鼠背部20%体表面积皮肤浸入97±1℃热水中18 s制作烧伤模型，并立即补充生理盐水40 ml/kg·bw，做好保温处理并随时观察大鼠状态和复苏情况，烧伤前组与对照组不作处理，大鼠自由地饮水和进食，每日观察大鼠的一般状态并记录体质量。

1.2.2动物取材10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，颈椎脱臼处死，迅速取出肠组织。

1.2.3病理组织学观察大鼠小肠组织10%中性甲醛溶液中固定，脱水、透明，石蜡包埋、切片，HE染色，镜下观察。

1.2.4免疫组化石蜡切片脱蜡水化，98℃柠檬酸抗原修复液5 min，冷却至室温。加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育12 min，动物非免疫血清封闭30 min，兔抗大鼠SCF抗体(1∶200稀释)4℃孵育过夜，生物素标记的羊抗兔的二抗，室温作用30 min，链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶30 min，DAB显色，苏木精复染后脱水透明，中性树胶封片。

1.2.5蛋白印迹提取各组大鼠小肠组织总蛋白，上样量30 μg，电泳、转膜、牛奶封闭，兔抗大鼠SCF(1∶2 000稀释)4℃孵育过夜，HRP标记的二抗(1∶2 000稀释)室温作用1 h，暗室中曝光显影定影。Quantity One软件分析SCF灰度值与内参ACTB灰度值的比值代表定量值。

1.3统计学分析

2结果

2.1一般状态和体质量

造模结束后，对照组大鼠状态良好；烧伤模型组大鼠皮肤创面早期呈现苍白色，一天后变暗逐渐转为焦黑色，脱水后局部变硬可形成焦痂，有的可见栓塞血管，皮下组织间隙积液。模型组大鼠精神不佳，进水进食和活动减少。实验初始体质量各组间无差异，对照组体质量逐渐上升，而烧伤组大鼠体质量增长缓慢，至烧伤后2天和4天烧伤组体质量显著低于对照组(P<0.05)(见图1)。

注：*P<0.05，与对照组比较

2.2病理组织学观察

烧伤前组大鼠皮肤组织层次清晰，结构完整，烧伤组大鼠皮肤损伤累及全层，出现不同程度血管充血，角质层脱落，细胞坏死，炎性细胞浸润(图2)。证实严重烧伤模型造模成功。

烧伤前组小肠细胞形态正常，绒毛结构完整、排列整齐；烧伤模型组大鼠肠组织有不同程度损伤表现，间质和固有层水肿，绒毛顶端囊状间隙甚至脱落，上皮细胞变性坏死。2天损伤表现最为严重，4天有所改善(见图3)。

2.3免疫组化结果

烧伤后一天时SCF表达量与烧伤前相比减少，第二天后表达量有些回升，且各组间比较差异显著(P<0.05)(见图4)。

2.4Western blot结果

与烧伤前比较，SCF蛋白在烧伤后1天组大鼠肠组织中表达量有所下降，2天组和4天组明显增高，差异显著(P<0.05)(见图5)。

A烧伤前组 B 烧伤1天组 C烧伤2天组 D烧伤4天组

A烧伤前组 B 烧伤1天组 C烧伤2天组 D烧伤4天组

A烧伤前组 B 烧伤1天组 C烧伤2天组 D烧伤4天组

注：*P<0.05，与烧伤前组比较；#P<0.05，与烧伤后1天组比较

3讨论

烧伤模型组大鼠皮肤苍白，碰触没有疼痛反射，转而变暗变硬形成焦痂，有的可见树枝状血管栓塞，HE结果显示烧伤累及大鼠皮肤组织全层，结合烧伤范围基本可以确定严重烧伤造模成功。肠组织HE染色可见于烧伤后1天大鼠小肠组织绒毛上皮细胞变性坏死，排列紊乱，绒毛顶端出现囊状间隙甚至脱落，间质和固有层水肿。2天损伤表现最为严重，4天有所改善。肠组织在严重烧伤时可有明显病理损伤。小肠粘膜细胞生长快，4天即可以完成一次自我更新。考虑为烧伤后部分尚有功能干细胞更替受损上皮细胞[9]，故烧伤后4天可见有一些好转。

干细胞因子是一种酸性糖蛋白，是骨髓基质细胞在骨髓微环境中所产生的。有研究发现干细胞因子可以改变骨髓间充质干细胞(BMSCs)的微管结构[10]，促进BMSCs定位到损伤的心肌和肝脏组织并分化成具有功能细胞在损伤局部发挥修复作用[11,12]。此外可以调控胃肠道Cajal间质细胞生长发育、繁殖、功能以及维持肠道免疫[2,3]。

我们的研究结果显示相对于烧伤前，烧伤后1天SCF蛋白表达有所降低，2天开始回升，4天基本恢复至损伤前的状态。以往的研究曾报道烧伤可以导致大鼠肠系膜微动脉血管管径减小，血液流速降低、流量减少[13]1天后逐渐回升[14]。大鼠肠在烧伤应激时结肠组织干细胞因子SCF的编码基因Kitl在损伤后表达降低，2天后开始有所回升[15]。我们的实验结果与上述研究时间规律基本吻合。可能为烧伤后肠组织损伤促使骨髓干细胞动员，血液干细胞因子增多，而短期肠组织循环血量减少导致短暂低值。之后血运逐渐恢复，干细胞因子随之到达受损组织，此外干细胞因子可以进一步刺激干细胞动员至损伤部分[16]致使局部组织干细胞因子编码基因表达增高。

干细胞因子在烧伤后小肠组织表达的增多具体是通过什么途径完成，其对烧伤肠组织损伤是否具有修复作用和具体机制仍待进一步证实。

参考文献：

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基金项目：国家自然科学基金(81573067)； 吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20130413023GH)；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(2015533)；吉林省卫生计生科研计划项目(2014Z046)

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)06-0875-04

中图分类号：R392

文献标识码：A

(收稿日期：2015-12-18)

Expression of stem cell factor in the intesines in the severely burned rats

WANGYong-jie1,YANJun1,LILei1,etal.

(1.DepartmentofToxicology,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun130021,China;2.DepartmentofOrthopedic,China-JapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the small intestinal injury and stem cell factor expression of the damaged intestinal tissues in rats at different time after severe burn.MethodsMale Wistar rats were randomly divided into 5 groups:group before burn,severe burn models on day 1,day 2,day 4,and control group,6 rats in each group.Severe burn models were prepared,rats body weights were recorded and general status were observed daily.Histopathological changes of small intestines of rats were observed by HE staining,detection of SCF expression was carried out by immunohistochemistry and Western blot.ResultsRats body weights increased gradually in the control group,body weights of model groups on the second and fourth days after severe burn were significantly lower than that in the control group (P<0.05).HE staining results showed that small intestines in the group before burn arranged neatly,cells presented normal morphology;in burn model groups,rats had varying degrees of burn injury,such as interstitial and propria edema,and epithelial cells degeneration and necrosis the top of villus fallen off.Pathological changes were most serious on the second day.Immunohistochemistry and Western blot results both showed SCF expression significantly reduced 1 day after burn compared with group before burn(P<0.05),rallied notablely on day 2 and day 4.ConclusionSevere burn can lead to intestinal injury of rats,SCF plays a role in burn-induced intestinal injury of rats.

Key words:burn;intestinal injury;stem cell factor