抗酸杆菌液基薄层涂片方法的临床应用研究

贺　雄，杨栗坤，曹艳龙，孙雯娜，王心静，程小星，王仲元



抗酸杆菌液基薄层涂片方法的临床应用研究

贺雄，杨栗坤，曹艳龙，孙雯娜，王心静，程小星，王仲元

［摘要］目的 评价结核分枝杆菌液基薄层涂片法对不同类型标本的染色检查效能。方法 对200份住院1周内结核病患者的标本同时进行液基薄层方法与直接涂片法镜检抗酸杆菌，其中包括148份晨痰标本，52份体液标本，比较2种方法的阳性检出率。结果 排除16份重复标本，9份未进行分枝杆菌培养的标本，纳入的123份痰标本中，液基薄层法阳性率33.33％，直接涂片法阳性率24.39％，差异有统计学意义（P=0.012）；培养阳性病例的痰标本中，液基薄层法阳性率58.82％，直接涂片法阳性率44.12％，差异有统计学意义（P=0.018）。52份体液标本中，液基薄层法阳性率13.46％，直接涂片阳性率1.96％，差异有统计学意义（P=0.041）；培养阳性病例的16份体液标本中，液基薄层法阳性比例为7/16，直接涂片法阳性比例为1/16， 差异有统计学意义（P=0.040）。结论 基于液基薄层方法的抗酸杆菌涂片阳性率高于直接涂片法，对于体液标本阳性率提高显著，有利于临床上快速诊断，但对于痰标本的应用须综合考虑检验时长和检验费用。

［关键词］分枝杆菌属；结核；诊断；临床实验室技术

抗酸杆菌涂片显微镜检查方法是最早的结核病实验室检验手段，目前仍然是结核病检验方法学的基础，具有快速、价廉的优势，对判断患者的传染性具有重要意义，因此对它的研究和改进从未停歇过，目标是提高涂片镜检的阳性率。

基于液基薄层方法的抗酸杆菌涂片方法（抗酸杆菌液基薄层涂片方法）以较早应用于脱落细胞检查的液基薄层细胞学方法为基础，对标本进行解粘联去杂质处理后离心制片。我们用临床上不同部位来源的标本对此方法和临床普遍应用的直接涂片方法做了对照研究。

1　材料与方法

1.1 材料 材料系解放军第三○九医院结核病临床实验室于2015年7月接收的结核科住院患者入院1周内的临床检测标本，患者临床诊断均为“结核病”。分枝杆菌MGIT 960培养基和 培养分析仪购自美国BD公司。液基薄层试剂盒和消化液分别由湖南天骑公司和武汉瑞新昌生物公司提供。

1.2 方法 临床送检的“涂片找抗酸杆菌”的标本进行直接涂片后，剩余标本同时进行液基薄层涂片。直接涂片法按照《结核病实验室检验规程》［1］进行标本涂片、染色、镜检和记录结果。液基薄层涂片法分别按照湖南天骑和武汉瑞新昌生物公司提供的方法说明书进行。基本过程为：在专有标本瓶中进行标本的消化液处理，配套离心机内制备甩片、烘干、染色及镜检。分枝杆菌培养按照操作程序指南《BACTECTMMGITTM960 Mycobacterial Detection System》［2］进行标本的分枝杆菌培养，并记录结果。

1.3 统计学处理 采用CHISS 2004软件进行统计分析。2种方法相关性比较用四格表χ2检验/校正χ2检验/确切概率检验，2组率的比较采用配对四格表χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1 标本类型及纳入数量 共检测200份标本，其中包括148份晨痰标本，52份体液标本。排除16份重复标本和9份未进行分枝杆菌培养的标本，共纳入123份痰标本和52份体液标本。标本类型和数量见表1。

表1　标本类型和数量Table 1 Types and numbers of clinical samples

2.2 痰标本的检测结果 用2种方法对123份结核患者痰标本进行检测，结果见表2。一致性分析结果表明2种方法具有相关性（P＜0.05）， 液基薄层法阳性率（33.33％）明显高于直接涂片法阳性率（24.39％）（P＜0.05）。

表2　2种涂片方法检测痰标本结果（例）Table 2 Results of detecting sputum samples by two smear methods （cases）

用2种方法对68份结核分枝杆菌痰培养阳性痰标本进行检测，结果见表3。一致性分析结果表明2种方法具有相关性（P＜0.05）， 液基薄层法阳性率（58.82％）明显高于直接涂片法阳性率（44.12％）。因为结核分枝杆菌痰培养阳性具有确诊价值，所以液基薄层法灵敏度为58.82％，直接涂片法灵敏度为44.12％， 前者明显高于后者（P＜0.05）。

表3　2种涂片方法检测68例痰培养阳性痰标本结果（例）Table 3 Results of detecting 68 sputum samples with positive culture by two smear methods （cases）

2.3 体液标本的检测结果 用2种方法对52份结核患者体液标本进行检测，结果见表4。一致性分析结果表明2种方法无相关性（P＞0.05），液基薄层法阳性率（13.46％）明显高于直接涂片法阳性率（1.96％）（P＜0.05）。

表4　2种方法检测体液标本结果（例）Table 4 Results of detecting body fluid samples by two smear methods （cases）

用2种方法对16份结核分枝杆菌体液培养阳性体液标本进行检测，结果见表5。一致性分析结果表明2种方法无相关性（P＞0.05）， 液基法薄层阳性比例为（7/16）明显高于直接涂片法阳性比例（1/16）（P＜0.05）。

表5　2种涂片方法检测16例体液培养阳性体液标本结果（例）Table 5 Results of detecting 16 body fluid samples with positive culture by two smear methods （cases）

3　讨　　论

结核病实验室检查是发现传染源的最主要手段，是结核病确诊、治疗方案选择和疗效考核的主要依据［3］。2015年我国结核病的发病数和死亡数均占乙类传染病的第2位，结核病的控制依旧任重道远［4］。目前，结核病实验室检查方法中的分枝杆菌培养仍是结核病诊断的“金标准”，而涂片镜检仍是临床上最常使用的筛查方法。

目前临床上广泛使用的涂片镜检法是直接涂片法。涂片镜检简单、快速且成本低，但灵敏性低。为提高此方法的灵敏性，研究者对它的各个细节进行了优化［5］。抗酸杆菌液基薄层涂片方法以液基薄层细胞学方法为基础，对标本进行解粘联去杂质处理后离心制片。目前国内有2种不同的薄层离心制片机，我们在正常进行临床标本检验的同时，用这2种薄层离心制片机进行了涂片镜检。但其中的甩片机制备的涂片过薄（RXC-YJ-4880），经过2次检测后，因涂片过薄，部分呈空白片，我们放弃了对此制片方法的比较研究。另一种（TD-12）薄层离心制片的涂片方法结果良好，痰标本和体液标本的检测阳性率虽然与以往研究的报告有差异，但也均显著高于直接涂片法［6-7］。

为比较液基薄层涂片方法的灵敏性，我们只选取了临床上明确诊断为结核病，治疗不足1周的患者标本，而且这些患者同时送检了分枝杆菌培养，以分析比较此方法对培养阳性标本检测的敏感度。对所有的痰标本，液基薄层法阳性率明显高于直接涂片法阳性率；培养阳性病例的痰标本中，液基薄层法阳性率也高于直接涂片法阳性率，其结果均有统计学差异。52份体液标本中，液基薄层法阳性率明显高于直接涂片阳性率；培养阳性病例的体液标本中，液基薄层法阳性比例也明显高于直接涂片法阳性比例，差异均具有统计学意义。但液基薄层法对体液的检测阳性率提高更为显著。体液标本的常规涂片方法是先对标本进行离心沉淀处理，之后再采集沉淀物直接涂片。常规处理时，离心时间长，持续20～30 min。而且沉淀物主要是大量的纤维蛋白或者黏稠的脓液或者细胞碎片，在体液标本含菌量少的情况下，直接镜检的阳性率非常低。液基薄层法一方面对标本做前处理时液化了黏稠物质，裂解了上皮细胞，减少了干扰；另一方面液基薄层法的标本盒容量相对大，标本直接离心到镜检载玻片上，较大程度浓缩了标本中的细菌，所以液基薄层法能够显著提高体液标本的涂片阳性率。

液基薄层法须要进行标本前处理、离心等步骤，检测耗时较长，作为结核病专科检验室，痰标本检测量大，如果处理时间长，可能影响技术人员的阅片效率，而技术人员的阅片效率是影响涂片阳性率的重要因素，液基薄层法的成本支出也高于直接涂片法。但对于体液标本，抗酸杆菌液基薄层涂片方法的阳性率提高显著，有利于临床上快速诊断。因此，对于痰标本，是否应用液基法涂片，须要综合考虑检验室标本量、人员配给和其他快速检验项目等因素。目前，结核分枝杆菌基因芯片技术及高通量的基因测序等技术已逐步在临床实验室应用，为结核病的诊治带来重大的发展和变化［8］。

【参考文献】

［1］ 赵雁林，逄宇. 结核病实验室检验规程［M］. 北京：人民卫生出版社，2015：18-24.

［2］ Becton， Dickinson and Company. BACTECTMMGITTM960 Mycobacterial Detection System［EB/OL］. ［2016-3-10］. http：//www.bd.com/ds/productCenter/MT-Bactec.asp.

［3］ 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 卫生部关于印发《结核病预防控制工作规范》的通知［EB/OL］. ［2016-03-10］. http：//www.moh.gov.cn/mohbgt/pw10712/200804/19014.shtml.

［4］ 王永怡，王姝，张云辉，等. 2015年全球传染病相关热点回顾［J］. 传染病信息，2016，29（1）：30-34.

［5］ Molicotti P， Bua A， Zanetti S. Cost-effectiveness in the diagnosis of tuberculosis： choices in developing countries［J］. J Infect Dev Ctries， 2014， 8（1）：24-38.

［6］ 梁湘晖，宋婕，刘文恩. 液基集菌制片技术检测抗酸杆菌的临床应用研究［J］.中国防痨杂志，2009，31（2）：86-89.

［7］ 成灿. 液基夹层法检测灌洗液穿刺液中结核杆菌的临床应用［J］. 中国现代医学杂志，2012，22（32）：83-85.

［8］ 王心静，王仲元.结核病实验室诊断新技术的临床应用［J］.传染病信息，2014，27（3）：373-376.

（2016-03-16 收稿 2016-05-11 修回）

（责任编委 曲 芬 本文编辑 卢福昱）

［文献标志码］［中国图书资料分类号］ R378.91 A

［文章编号］1007-8134（2016）00-0153-03

DOI：10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.007

*Corresponding author， E-mail： xinjing15@163.com

［基金项目 ］国家自然科学基金面上项目（81071319）；国家“十二五”科技重大专项（2013ZX10003006-003）

［作者单位］100091 北京，解放军第三○九医院结核病研究所（贺雄、杨栗坤、曹艳龙、孙雯娜、王心静、程小星、王仲元）

［通讯作者 ］王心静，E-mail∶ xinjing15@163.com

Clinical application of acid-fast bacilli smear method based on liquid-based cytology

HE Xiong， YANG Li-kun， CAO Yan-long， SUN Wen-na， WANG Xin-jing*， CHENG Xiao-xing， WANG Zhong-yuan
Institute of Tuberculosis， 309 Hospital of PLA， Beijing 100091， China

［Abstract］Objective To evaluate the diagnostic performance of smear method based on liquid-based cytology in detecting acid-fast bacilli in clinical specimens of different types. Methods A total of 200 samples including 148 samples of morning sputum and 52 samples of body fluid， which were collected from patients within one week since they were hospitalized， were examined for acid-fast bacilli by direct smear method and liquid-based smear method at the same time. The positive rates of the two methods were compared. Results Sixteen repeated samples and 9 samples without being cultured for acid-fast bacilli were excluded， so 123 samples of morning sputum and 52 samples of body fluid were included. As for 123 sputum samples， the positive rates were 33.33％ for liquid-based smear method and 24.39％ for direct smear method， and the difference was significant （P=0.012）； the positive rates were 58.82％ for liquid-based smear method and 44.12％ for direct smear method in culture-confirmed sputum samples， and the difference was significant （P=0.018）. As for 52 samples of body fluid， the positive rates were 13.46％ for liquid-based smear method and 1.96％ for direct smear method， and the difference was significant （P=0.041）； 7 samples were positive for liquid-based smear method and 1 for direct smear method in culture-confirmed sputum samples （16 samples）， and the difference was significant （P=0.040）. Conclusions The positive rate of detecting acid-fast bacilli by liquid-based smear method is higher than that by direct smear method， especially for body fluid specimens. The liquid-based smear method is useful for clinical rapid diagnosis. However， for the sputum specimens， the examination time and the cost should be considered.

［Key words］Mycobacterium； tuberculosis； diagnosis； clinical laboratory techniques