3型天然淋巴细胞在HIV-1慢性感染中的免疫特征及其与疾病进展的关系研究

张　昕，涂　波，赵娟娟，聂为民，陈威巍，王福生，张　政



·论 著·

3型天然淋巴细胞在HIV-1慢性感染中的免疫特征及其与疾病进展的关系研究

张昕，涂波，赵娟娟，聂为民，陈威巍，王福生，张政

［摘要］目的 探讨HIV-1慢性感染过程中，外周血3型天然淋巴细胞（group 3 innate lymphoid cells， ILC3s）的频率变化及其与疾病进展的关系。方法 募集48例HIV-1慢性感染者和17例健康对照，留取外周血并分离单个核细胞，进行流式细胞检测ILC3s频率，同时分析ILC3s频率与患者外周血CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量的相关性。结果 与健康对照比较，HIV-1感染者外周血总的ILC3s频率显著下降（P＜0.001） ；其中尤以NCR-ILC3s下降更为显著（P＜0.001）。进一步分析显示：HIV-1感染者外周血ILC3s频率与CD4+T淋巴细胞计数呈弱正相关（r=0.461，P= 0.001），而与血浆病毒载量呈弱负相关（r=-0.399， P= 0.005）。结论 HIV-1慢性感染者外周ILC3s显著减少，并与疾病进展密切相关。该研究为阐明HIV-1慢性感染致病机制提供了新的解释。

［关键词］HIV-1；HIV感染；T-淋巴细胞， 辅助诱导；CD4-阳性T淋巴细胞

天然淋巴细胞（innate lymphoid cells， ILCs）是新近鉴定的一群淋巴细胞，不表达T细胞受体，在天然免疫反应和组织修复重建中具有调节功能［1］。根据特定转录因子的表达，细胞表面标志物和细胞因子产生种类，ILCs可以分为3型［2-3］：1型ILCs（ILC1s）定义为CD45+lin-CD127+CD117-细胞，主要产生IFN γ，依赖于T细胞表达T盒发挥作用［4］；2型ILCs（ILC2s）是CD45+lin-CD127+CRTH2+的细胞，主要产生IL-5和IL-13等2型细胞因子，依赖GATA分子合蛋白3发育［5］；3型ILCs（ILC3s）是CD45+lin-CD127+CD117+细胞，主要产生IL-17、IL-22，依赖转录因子RORγt发育［6］。研究表明，ILCs的变化与人类多种疾病的发生发展密切相关［7］。

ILC3s是人体内重要的一类ILCs亚群，在肠道自身免疫性疾病以及感染性疾病的进展中均发挥重要作用。有研究显示，猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus， SIV）急、慢性感染可导致产生IL-17的ILCs细胞持续减少，尤其在肠道中更显著［8-9］，但ILC3s在HIV-1慢性感染中的变化及其与疾病进展的关系尚不清楚。本文拟对HIV-1慢性感染者外周血ILC3s的频率及其与反映疾病程度指标的相关性进行研究，并探讨ILC3s的变化在HIV-1感染后免疫致病过程中的作用机制。

1　对象与方法

1.1 对象 所有HIV-1慢性感染者（HIV感染组）均来自于2013年1月—2014年12月就诊于解放军第三〇二医院的患者。纳入标准如下：①年龄18～65岁，自愿参加本研究者；②经免疫印迹法（Western Blot， WB）确诊的HIV-1感染者；③还未开始高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy， HAART）；④无机会性感染；⑤无糖尿病、高血压、心脏病等慢性器质性疾病者。排除标准：①年龄＜18岁或＞65岁者；②已经开始HAART治疗者；③妊娠妇女或产褥期妇女；④目前存在机会性感染者；⑤精神病患者，或其他不能合作或不愿合作者。通过筛选，共纳入患者48例，其中，男41例，女7例，平均年龄（34.1±11.6）岁。38例通过性途径传播，6例通过血液途径传播，4例不明。CD4+T淋巴细胞均值300（9～986）/μl，血浆HIV载量均值81 600（＜40～731 000）copies/ml。同时，我们募集了17例年龄、性别相当的健康个体作为健康对照组，其中，男14例，女3例；平均年龄（31.1±10.8）岁。入组所有病例及对照均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 本实验所用的主要荧光抗体如下：小鼠抗人CD45-APC-Cy7（美国 BD Pharmingen公司）、小鼠抗人lineage-FITC（美国 BD公司）、小鼠抗人CD127-PE-Cy7（美国Biolegend公司）、小鼠抗人CD117-BV421（美国Biolegend公司）和小鼠抗人NKp44-APC（美国Biolegend公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 Ficoll-Hypaque密度离心法分离单个核淋巴细胞 取新鲜采集的肝素钠抗凝血，离心去除血浆后，用PBS缓冲液稀释1倍，加至淋巴细胞分

离液上层，2500 r/min，离心25 min，取中间白膜层（即单核细胞和淋巴细胞富集层），PBS缓冲液洗涤2遍，得到外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMCs）。

1.3.2 流式细胞仪检测ILC3s亚群的表达 PBMCs计数后悬于含2％胎牛血清的PBS缓冲液中，调整浓度为2.0×107cells/ml。染色步骤如下：①取2支流式管，分别标记检测管和对照管，均加入100 μ l PBMCs悬液。②检测管加入抗体组合，相应的对照管加入同型抗体组合，混匀后4 ℃避光孵育30 min。③用2 ml含2％胎牛血清的PBS缓冲液洗涤2次，1200 r/min离心5 min后，弃上清。④两管均加入1％多聚甲醛固定，2～8 ℃避光存放，等待上机检测。调整流式细胞仪（FACS Verse，美国BD公司）参数设定后，使用相同电压和荧光补偿检测各管样本。每管样本至少获取1×106个有核细胞的荧光和散射光信号，使用Flowjo分析软件进行ILC3s亚群分析。

2　结　　果

图1　ILC3s圈门策略Figure 1 Gating strategy for ILC3s

2.1 流式圈门策略 首先，我们设定了流式染色方案（图1）。圈定淋巴细胞群，选定CD45+白细胞，而后选定lineage阴性细胞。根据CD127和CD117，我们圈定外周CD127+CD117+的淋巴细胞为ILC3s，这一细胞亚群又进一步根据NKp44表达与否分为NCR+ILC3s（Lin-CD127+CD117+NKp44+）和NCR-ILC3s（Lin-CD127+CD117+NKp44-）亚群。2.2 HIV-1感染 者 外周血ILC3s的频率变化 所有HIV-1感染者PBMCs均包含Lin-CD127+CD117+ILC3s。与健康人外周血ILC3s频率［（7.711％±3.728％），以占CD45+Lin-细胞比例计算，以下同］比较，HIV-1感染者的外周血ILC3s频率［2.980％（1.523％，3.848％）］显著降低（U=93.500，P= 0.000），见图2A。进一步观察NCR-ILC3s和NCR+ILC3s频率在HIV-1感染者的变化发现，HIV-1感染者NCR-ILC3s的频率［2.720％（1.410％，3.785％）］显著低于健康人（7.308％±3.648％）（U=101.500，P=0.000），见图2B。而NCR+ILC3s的频率［0.10％（0.00％，0.35％）］同样低于健康对照组［0.29％（0.09％，0.67％）］，（U=270.000，P＜0.031），见图2C。

图2　HIV感染组与健康组外周血总ILC3s、NCR-ILC3s以及NCR+ILC3s频率A. 2组间ILC3s频率差异；B. 2组间NCR-ILC3s频率差异；C. 2组间NCR+ILC3s频率差异Figure 2 Frequencies of ILC3s， NCR-ILC3s and NCR+ILC3s in HIV-infected group and healthy control group

2.3 HIV-1感染者外周血ILC3s细胞与疾病进展的关系 我们进一步分析了HIV-1感染者外周血ILC3s频率与疾病进展的重要标志物：外周血CD4+T淋巴细胞计数和血浆HIV-1载量的相关性。分析表明，HIV-1感染者外周血ILC3s的百分比与其外周血CD4+T淋巴细胞计数呈弱正相关（r=0.461， P=0.001），见图3；而与血浆中HIV-1病毒载量的常用对数（lg）呈弱负相关（r=-0.399，P=0.005），见图4。这些数据表明外周ILC3s的减少与HIV-1感染者的疾病发展相关。

图3　HIV-1慢性感染者外周血CD4+ T淋巴细胞计数与ILC3s频率相关性Figure 3 Association between CD4+T lymphocute counts and the frequency of ILC3s in patients with chronic HIV-1 infection

3　讨　　论

ILCs亚群在HIV-1感染中的变化特点及其与疾病进展的关系尚不明确。本研究初步观察了HIV-1慢性感染者外周血ILC3s的频率变化，发现HIV-1慢性感染显著删除了机体ILC3s细胞，并且这种降低与疾病进展密切相关。该研究为HIV-1感染的致病机制提供了新的机制解释，为进一步发现新的治疗靶标提供了重要依据。

本研究结果显示，随着HIV-1感染病情进展，ILC3s进行性降低，尤其以NCR-ILC3s为主。下降的原因还不清楚，可能与HIV-1诱导的凋亡增加或组织迁移有关系［8］。将来的研究须要进一步明确凋亡相关的分子，例如Fas/FasL、TRAIL等关键凋亡分子在HIV-1中的表达；以及患者淋巴组织内ILC3s的变化情况。此外，NCR+和NCR-ILC3s的差异删除的原因也须要进一步阐明。

以往研究证实，ILC3s主要产生IL-17和IL-22，这两种细胞因子通过促进肠道上皮细胞完整性而维持着黏膜免疫屏障功能［10-11］。研究表明，慢性HIV-1/SIV感染中多种产生上述细胞因子的细胞，例如Th17细胞、NKp44+NK22细胞和CD3-CD8hi亚细胞群，均显著下降［7，12］。这些细胞的减少将破坏肠道黏膜完整性，导致微生物移位，进而引起免疫超活化和疾病发展。将来的研究应该阐明HIV-1慢性感染过程中，ILC3s产生IL-17和IL-22等细胞因子的能力的变化特点及其与肠道免疫屏障功能损伤的关系。

我们的研究还发现，HIV感染者ILC3s减少与CD4+T淋巴细胞计数呈弱正相关，而与血浆HIV-1载量呈弱负相关，提示ILC3s可以充当新的免疫标志物。将来的大样本研究队列可能会阐明在HIV-1慢性感染过程中，ILC3s数量减少作为疾病进展预测标志物的特异性和敏感性。

许多研究已经证实，ILCs亚群具有组织分布的特异性。例如ILC1s，包括自然杀伤细胞，主要存在于胎儿肠道和肝内；ILC2s主要存在于人类外周血、肺部和肝脏；ILC3s主要存在于人类皮肤组织、胸腺、扁桃体、脾脏和肠道内［6，13-15］。由于获得人体组织的方法有限，我们的研究仅限于HIV感染者的外周血ILC3s，因而不能很好地描述人体组织内的ILCs亚群免疫学特点及其在健康状态和疾病状态下的功能差异。

总之，我们发现HIV-1慢性感染者外周血ILC3s显著减少，并与疾病进展密切相关。该研究从另一个新的角度阐明了ILC3s在HIV-1慢性感染中的免疫保护机制，也为进一步发现新的治疗靶标提供了重要依据。

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（2016-01-18 收稿 2016-02-15 修回）

（责任编委 王永怡 本文编辑 卢福昱）

［文献标志码］［中国图书资料分类号］ R512.91 A

［文章编号］1007-8134（2016）03-0144-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.005

*Corresponding author， E-mail： zhangzheng1975@aliyun.com

［基金项目］全军“十二五”科研重点项目（BWS12J006）

［作者单位］100039 北京，解放军第三〇二医院感染性疾病诊疗与研究中心（张昕、涂波、聂为民、陈威巍、王福生 ），临床研究管理中心（赵娟娟、张政）（张昕、涂波为并列第一作者）

［通讯作者］张政，E-mail∶ zhangzheng1975@aliyun.com

Characteristics of group 3 innate lymphoid cells in chronic HIV-1 infection and their associations with disease progression

Zhang Xin， TU Bo， ZHAO Juan-juan， NIE Wei-min， CHEN Wei-wei， WANG Fu-sheng， ZHANG Zheng*
Research Center for Treatment and Diagnosis of Infectious diseases， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China

［Abstract］Objective To evaluate the changes of the frequency of group 3 innate lymphoid cells （ILC3s） in peripheral blood in patients with chronic HIV-1 infection and its association with disease progression. Methods A total of 48 patients with chronic HIV-1 infection and 17 healthy controls were enrolled in the study. Peripheral blood mononuclear cells were used to detect the frequency of ILC3s. In addition， the associations between the frequency of ILC3s and peripheral blood CD4+T lymphocyte counts and plasma HIV-1 load were further analyzed. Results As compared with healthy controls， the frequency of ILC3s decreased significantly in patients with chronic HIV-1 infection （P＜0.001）， particularly that of ILC3s with natural cytotoxicity receptors negative decreased more significantly. Further analysis indicated that the frequency of ILC3s was weakly positively correlated with peripheral blood CD4+T lymphocyte counts （r=0.461， P=0.001） and weakly negatively correlated with plasma HIV-1 load （r=-0.399， P=0.005）. Conclusions The frequency of peripheral blood ILC3s decreases significantly in patients with chronic HIV-1 infection， and is associated with disease progression. This study highlights a novel mechanism in the immune pathogenesis in chronic HIV-1 infection.

［Key words］HIV-1； HIV infections； T-lymphocytes， helper-inducer； CD4-positive T-lymphocytes