化痰活血方对实验性高脂血症大鼠的研究

朱志刚　姚映芷



·论著·

化痰活血方对实验性高脂血症大鼠的研究

朱志刚姚映芷

210023南京中医药大学基础医学院中药学教研室[朱志刚(硕士研究生)、姚映芷]

【摘要】目的研究化痰活血方对实验性高脂血症大鼠的影响。方法通过建立高脂血症大鼠模型，灌胃给予化痰活血方(荷叶、海藻、决明子、三七、丹参、姜黄)2659.5 mg/(kg·d)，给药4周，测定血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)，计算动脉粥样硬化指数(AI)和TC/HDL-C，并做肝组织病理切片。结果化痰活血方能降低血清TC、TG、LDL-C的含量及CRP、AI指数、TC/HDL-C比值、AST、ALT。结论化痰活血方对高脂血症大鼠血脂水平具有一定的调节作用，对高脂血症引起的肝功能损伤具有改善作用，且较阿托伐他汀不会引起肝功能损害。

【关键词】化痰活血方；高脂血症；大鼠实验

随着现代生活水平的提高，心血管疾病的发病率和死亡率一直呈上升趋势，而高脂血症(hyperlipidemia，HLP)是导致动脉粥样硬化及心血管疾病的最危险因素之一，严重威胁着人类的健康[1-2]。高脂血症是指血清中总胆固醇、甘油三脂或低密度脂蛋白过高或高密度脂蛋白过低的一种常见而多发的全身代谢性疾病[3]。通过长期的跟踪治疗，虽然西药降脂药功效显著，但无论是烟酸类、贝特类、胆酸螯合类，还是现在主流的他汀类降脂药，都存在着患者耐受性差、个体差异明显以及长期服用可能会发生腹泻、便秘、脱皮、皮疹、血栓性血小板减少性紫癜，并可引起血清转氨酶升高，甚者可发生横纹肌溶解等方面的不足，限制其不能长期使用[4-7]。而经过大量的研究，已证实中药可以很好地调节血脂，且与西药相比毒副作用相对要小[8-11]。因此，在中医理论指导下，寻找安全、疗效明确的调脂中药受到众多中医药学者的重视。基于南京中医药大学与德国埃尔朗根大学医学院的合作项目，本实验对临床“化痰活血方”治疗高脂血症进行验证，并对其药效进行比较，为进一步研发安全性较高的降脂中药提供客观依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料雄性SD大鼠48只，清洁级，体质量180～220 g(苏州昭衍新药研究中心有限公司提供，许可证号：201511643)；化痰活血方免煎冲剂(荷叶颗粒剂1.5 g、海藻颗粒剂6 g、决明子颗粒剂2.5 g、三七粉10 g、丹参颗粒剂8.75 g、姜黄颗粒剂0.8 g，颗粒剂购于江阴天江药业有限公司，产品批号：1510111)；阿托伐他汀钙片(商品名：立普妥，辉瑞制药有限公司提供，产品批号：L36728)。参照《药理实验方法学》[12]进行剂量换算，采用双蒸馏水溶解药物，4℃冰箱保存备用。高脂饲料(基础饲料76%、胆固醇1.5%、蛋黄粉10%、猪油7%、胆盐0.3%、丙基硫氧嘧啶0.2%、黄豆5%)委托青龙山动物繁殖场加工，送检江苏省理化测试中心检测合格，合格报告编号：2015XC-0527。高脂饮食组每天上午10～11点给予高脂饲料(20 g/只/天)。

1.1.2试剂总胆固醇(total cholesterol，TC)试剂盒(批号：A20022)、甘油三酯(triglyceride，TG)(批号：A20061)购于Autec Diagnostica公司；高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)试剂盒(批号：080301A)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)试剂盒(批号：101001A)购于Prodia Diagnostics公司；谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)试剂盒(批号：101001A)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)试剂盒(批号：101001A)均购于北京莱帮生物技术有限公司；C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)试剂盒(批号：A362)购于Beckman Coulter公司。

1.1.3仪器SHZ-82水浴恒温振荡器，江苏金坛市新航仪器厂生产；低速常温离心机，湖南恒诺仪器设备有限公司生产；电子分析天平，美国双杰集团有限公司生产；LED型电子秤，上海大川电子衡器有限公司生产；奥林巴斯AU2700大型全自动生化、免疫分析仪，日本OLYMPUS光学株式会社生产。

1.2动物造模、分组给药及取材

大鼠实验环境由南京中医药大学动物实验中心提供，标准号：SYXK(苏)2002-0123。将大鼠适应性饲养观察3天后，随机选取12只为空白对照组，饲以普通饲料，其余大鼠饲以高脂饲料，控制饲养温度为20℃左右，湿度50%～70%，自然光照，自由饮水。每周一及周四更换饮水及垫料,保持动物生活环境通风及清洁卫生。在实验过程中每周测一次体质量，并观察大鼠状态的变化。4周后，于前一夜禁食12小时后眼底丛静脉取血，检测血脂四项，采用分层区组随机化的方法，按TC和体质量分为3组，每组12只，分别为模型组、阿托伐他汀阳性药对照组和化痰活血方组。其中，阳性对照组灌胃给予阿托伐他汀1.8 mg/(kg·d)；化痰活血方组给予荷叶、海藻、决明子、三七、丹参、姜黄混合制剂2659.5 mg/(kg·d)；空白对照组和模型组灌胃给予等体积的生理盐水。分别在给药2、4周后禁食12小时，眼底丛静脉采血，测定各组大鼠血脂指标TC、TG、HDL-C、LDL-C及C-反应蛋白的含量。同时给药4周后，测定肝功能指标AST、ALT。从第29天起，禁食24小时，自由饮水，眼底静脉丛采血2.5 mL，在正常温度下3000 rpm离心10分钟，分离血清备用。同时取大鼠新鲜肝脏称重，取肝左叶组织，切成4～5 mm3小块，10%中性福尔马林固定、脱水，常规石蜡包埋、切片，进行HE染色，光镜观察。

1.3生化指标的测定

TC采用胆固醇氧化酶法测定；TG采用酶GPO-POD紫外法测定；HDL-C采用直接一步法法测定；LDL-C采用免疫化学比色法测定；AST，ALT采用速率法测定；C-反应蛋白(CRP)采用速率散射比浊法测定。计算动脉硬化指数(AI)，AI=TC-HDL-C/HDL-C。

1.4统计学处理

2结果

2.1大鼠体质量

各组大鼠的初始体质量在各组间分配均衡，无显著性差异(P>0.05)。从造模后到给药4周，模型组大鼠(饲喂高脂饲料)体质量均显著低于空白组(饲喂基础饲料)，可能与长时间饲喂高脂饲料而导致大鼠厌食有关，导致体质量下降。给药2、4周后，大鼠的体质量在化痰活血方组、阿托伐他汀组与模型组间比较，均无显著性差异(P>0.05)，即所给药物对大鼠体质量无明显影响。见表1。

2.2化痰活血方对TC、TG、HDL-C、LDL-C、TC/HDL-C及AI的影响

造模后，模型组大鼠血清的TC、TG含量均高于空白组(均P<0.01)，提示造模成功；给药组与高脂模型组相比，无显著性差异(P>0.05)，提示分组合理。与模型组相比，给药2、4周后，化痰活血方能显著降低高脂血症大鼠血清TC、TG含量。化痰活血方对实验性高脂血症大鼠血清TC、TG值，具有显著降低作用。见表2。

造模后，高脂模型组及两给药组大鼠血清LDL-C含量与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01)，HDL-C含量与空白组相比无显著性差异(P>0.05)，表明本实验造模方式对高脂血症大鼠血清HDL-C无影响，但是可以升高血清LDL-C含量。给药2、4周后，化痰活血方组高脂血症大鼠LDL-C含量显著降低，与模型组比较，具有极显著性差异(P<0.01)。化痰活血方对实验性高脂血症大鼠血清LDL-C值，具有显著降低作用，对血清HDL-C含量无影响。见表2。

造模后，高脂模型组大鼠TC/HDL-C比值及动脉硬化指数AI，与空白组相比具有极显著性差异(均P<0.01)。化痰活血方组大鼠给药2周后，血清TC/HDL-C及动脉硬化指数AI降低，与模型组比较均有显著性差异(均P<0.05)；给药4周后，化痰活血方组TC/HDL-C值降低(P<0.05)。化痰活血方可以降低实验性高脂血症大鼠血清TC/HDL-C比值，在给药2周后，可以降低AI值，给药4周后，AI值降低不明显。见表2。

表1　化痰活血方对高脂大鼠体质量的影响±s，g)

注： 与空白组相比，aP<0.05。

表2　化痰活血方对高脂大鼠血清TC、TG的影响±s)

注： 与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

2.3化痰活血方对高脂血症大鼠肝功能指标的影响

与空白组比较，模型组大鼠肝功能指标AST、ALT显著升高，差异有统计学意义(均P<0.01)，与模型组比较，阿托伐他汀组不能显著降低ALT水平，而化痰活血方可以降低AST、ALT水平(均P<0.05)。提示化痰活血方对高脂血症引起的肝功能损伤具有一定的改善作用，且治疗高脂血症时较阿托伐他汀不会引起肝功能损害。见表3。

表3　化痰活血方对高脂大鼠肝功能指标的影响±s)

注： 与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

2.4化痰活血方对高脂血症大鼠C反应蛋白的影响

造模后，模型组大鼠CRP指数与空白组相比，无显著性差异。给药4周后，与模型组间比较，化痰活血方组高脂血症大鼠CRP指数降低(P<0.05)，说明化痰活血方可以降低高脂血症大鼠CRP的表达。见表4。

表4　化痰活血方对高脂大鼠CRP的影响±s)

注： 与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

2.5各组大鼠肝组织病理学检查的比较

正常组：肝细胞排列成单板结构，互相连接吻合。肝细胞内无脂肪沉积。模型组：肝细胞单板结构不清，肝细胞变大，肝细胞内大量脂质(溶解呈空泡状)，部分肝细胞核被推向一侧，胞浆内脂滴大小不一，有轻度的细胞水样变性和细胞坏死，炎症反应剧烈。模型组与空白对照组比较，脂肪变性明显。阿托伐他汀组：脂肪变性为主，肝内脂肪滴减少，散在分布，炎症细胞浸润减轻，偶见细胞坏死和水样变性。化痰活血方组：肝脏脂肪变性有不同程度的改善，轻度脂肪变为主，肝内脂肪滴减少，散在分布，炎症细胞浸润较少，个别细胞坏死和水样变性。化痰活血方组与模型组相比较肝细胞脂肪变性均有不同程度的缓解。见图1。

注：A：空白组；B：模型组；C：阿托伐他汀组；D：化痰活血方组

图1各组大鼠实验8周后肝组织结构变化(×400)

3讨论

3.1大鼠高脂血症模型的建立

高脂饮食诱导大鼠高脂血症模型是目前研究高脂血症及其并发症的理想动物模型。经研究报道，其可能的机制是：血中游离脂肪酸(nonestesterified fatty acid，FFA)增多，肝脏中的FFA也增多，肝脏合成及释放TG增多；脂蛋白脂酶活性下降，使极低密度脂蛋白(very low densitylipoprotein，VLDL)及TG清除率下降；HDL水平下降的原因可能与载脂蛋白向VLDL转移以及HDL与VLDL交换有关[13-15]。本实验利用高脂饲料造模后发现，大鼠血清TG、TC、LDL-C含量均明显升高，提示造模成功。

3.2化痰活血方对高脂血症大鼠血脂代谢的影响

脂代谢紊乱是诱发高脂血症的关键原因，血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量可在一定程度反映机体脂肪代谢状况，是监测血脂变化的重要指标[16-18]。大量的动物实验、临床试验及预防治疗试验结果证实TC与动脉粥样硬化的发生、心血管病的发病率及死亡率有直接的关系，而降低TC可使动脉粥样硬化斑块稳定化[19-20]。流行病学研究也证实，高甘油三酯是冠心病独立的危险因子，LDL-C是血浆中胆固醇的主要载体，CRP参与了血栓形成和动脉硬化的病理过程，是脑卒中的危险因素之一[21-22]。一般认为，脂代谢紊乱是造成肝细胞脂肪变性的初始环节，它既能使体内增多的FFA直接损害肝细胞，又能使甘油三酯在肝脏内堆积[23]。因此，降低血脂、清除肝脏中累积的脂肪是治疗脂肪肝的重要方法[24]。近年来，中医药治疗高脂血症的方法颇多，运用化痰活血法治疗高脂血症的理论和临床研究，也取得了一定的成果，中医药治疗高脂血症效果明确，且毒副作用较小，可长期使用又可作为高脂血症的一级预防用药[25]。

本实验研究显示，化痰活血方(荷叶、海藻、决明子、三七、丹参、姜黄)能显著降低高脂血症大鼠血清TC、TG、LDL-C、AI水平及TC/HDL-C值，提示化痰活血方具有调节血脂、脂蛋白——胆固醇代谢的作用。肝功能指标显示，化痰活血方可以降低AST、ALT指标的值至正常水平，说明化痰活血方可对高脂血症引起的肝功能损伤具有改善作用，且治疗高脂血症时较阿托伐他汀不会引起肝功能损害。同时，肝脏病理检测显示，化痰活血方可减轻高脂血症大鼠肝脏病理损伤程度，可使脂变肝细胞数量明显减少，脂变面积明显减小，脂变程度明显减轻。CRP结果表明，化痰活血方可以降低感染性炎症反应的敏感指标CRP含量。整方的药效学研究表明，化痰活血方具有改善血脂紊乱、减轻肝脏脂肪性病变的作用，能够预防和治疗高脂血症及动脉粥样硬化、脂肪肝等高脂血症相关疾病。

本研究对化痰活血方的调脂作用及机理进行了初步地研究和探讨，在后续的研究中，将进一步从动物急性毒性试验和长期毒性试验两方面，考察化痰活血方的安全性，并就化痰活血方的作用机理及最佳剂量等展开深入研究，以研制开发出适宜血脂异常患者使用的新型调脂药物，满足临床和市场需求。

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(本文编辑： 董历华)

Research ofHuatanHuoxueformula on experimental hyperlipidemia rats

ZHUZhi-gang，YAOYing-zhi.

NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing,Jiangsuprovince, 210023，ChinaCorrespondingauthor：YAOYing-zhi，E-mail： 13851894784 @163.com

【Abstract】ObjectiveTo research the effects ofHuatanHuoxueformula on experimental hyperlipidemia rats. MethodsHyperlipidemia rats model was established and theHuatanHuoxueformula group was given the administration dosage of 2659.5 mg/(kg·d) by gavage for 4 weeks. The serum contents of TC, TG, HDL-C, LDL-C, AST, ALT, CRP were detected and the AI and TC/HDL-C content was figured out. Liver tissue pathological slices was observed. ResultsHuatanHuoxueformula could effectively reduce the contents of TC, TG, LDL-C, AI, AST, ALT figures, CRP and TC/HDL-C percent. ConclusionsHuatanHuoxueformula has a certain regulating effect on blood lipid level in hyperlipidemia rats, and can improve the liver function injury induced by hyperlipidemia, and does not cause liver function damage.

【Key words】HuatanHuoxueformula；Hyperlipidemia；Rat experiment

基金项目：南京中医药大学与德国埃尔朗根大学医学院合作项目(015009022001)

作者简介：朱志刚(1990- )，2013级在读硕士研究生。研究方向：心血管系统疾病中药配伍研究。E-mail：709804125@qq.com 通讯作者： 姚映芷(1958- )，女，本科，副教授，副主任医师。研究方向：心血管系统疾病中药配伍研究。E-mail：13851894784@163.com

【中图分类号】R285.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.07.003

(收稿日期：2016-03-11)