乙型肝炎肝硬化患者辅助性T淋巴细胞17和调节性T淋巴细胞及维甲酸相关核孤儿受体γt和叉状头/翅膀状螺旋转录因子3 mRNA表达水平的变化及其临床意义研究

涂 琛，游 晶，刘怀鄂，陈红英，洪 敏，刘子杰，娄 鸣



·论著·

乙型肝炎肝硬化患者辅助性T淋巴细胞17和调节性T淋巴细胞及维甲酸相关核孤儿受体γt和叉状头/翅膀状螺旋转录因子3 mRNA表达水平的变化及其临床意义研究

涂 琛，游 晶，刘怀鄂，陈红英，洪 敏，刘子杰，娄 鸣

650032 云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院感染科(涂琛，游晶，刘怀鄂，陈红英，娄鸣)，生物治疗中心(洪敏)，检验中心(刘子杰)

【摘要】目的通过对乙型肝炎肝硬化患者外周血辅助性T淋巴细胞17(Th17)、调节性T淋巴细胞(Treg)及其特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)和叉状头/翅膀状螺旋转录因子3(Foxp3) mRNA表达水平的检测探讨其临床意义。方法选取2015年7—12月昆明医科大学第一附属医院诊治的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者64例，其中慢性乙型肝炎(CHB)患者21例(CHB组)、代偿期肝硬化(CLC)患者21例(CLC组)、失代偿期肝硬化(DCLC)患者22例(DCLC组)。同期选取本院体检健康者20例为对照组。收集研究对象一般资料〔性别、年龄及丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)〕；应用流式细胞术检测研究对象外周血Th17、Treg表达率，计算Th17/Treg比值；应用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法测定外周血RORγt、Foxp3 mRNA表达水平。结果4组年龄、ALT、AST、TBIL比较，差异有统计学意义(P<0.05)。CHB组、CLC组、DCLC组Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值均高于对照组(P<0.05)；DCLC组Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值均高于CHB组，Th17表达率及Th17/Treg比值均高于CLC组(P<0.05)。CHB组、CLC组、DCLC组RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05)；DCLC组RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平均高于CHB组、CLC组(P<0.05)。CHB组、CLC组、DCLC组外周血Th17表达率与RORγt mRNA表达水平均呈正相关(P<0.05)；CHB组、CLC组、DCLC组外周血Treg表达率与Foxp3 mRNA表达水平均呈正相关(P<0.05)；CHB组、CLC组、DCLC组外周血Th17表达率、RORγt mRNA表达水平与ALT呈正相关(P<0.05)；CHB组外周血Foxp3 mRNA表达水平与ALT呈正相关(P<0.05)；CHB组RORγt mRNA表达水平、Foxp3 mRNA表达水平与AST、TBIL呈正相关(P<0.05)。结论Th17、Treg及其特异性转录因子RORγt、Foxp3可能与乙型肝炎肝硬化患者的疾病进展与肝功能有关。

【关键词】乙型肝炎；肝硬化；T淋巴细胞,辅助；T淋巴细胞,调节性；维甲酸相关核孤儿受体γt；叉状头/翅膀状螺旋转录因子3

涂琛，游晶，刘怀鄂，等.乙型肝炎肝硬化患者辅助性T淋巴细胞17和调节性T淋巴细胞及维甲酸相关核孤儿受体γt和叉状头/翅膀状螺旋转录因子3 mRNA表达水平的变化及其临床意义研究[J].中国全科医学，2016，19(18)：2130-2134.[www.chinagp.net]

Tu C,You J,Liu HE,et al.Changes of Th17 and Treg and the expressions of RORγt and Foxp3 mRNA in patients with HBV related liver cirrhosis and the clinical significance[J].Chinese General Practice，2016，19(18)：2130-2134.

在未行抗病毒治疗的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者中，肝硬化(LC)5年累计发生率为8%～20%，代偿期肝硬化(compensated liver cirrhosis，CLC)患者中，失代偿期肝硬化(decompensated liver cirrhosis，DCLC)5年累计发病率约20%，DCLC患者的5年生存率为14%～35%，而LC患者中，肝癌(HCC)每年发病率为2%～5%[1]。乙型肝炎病毒(HBV)感染的预后与机体免疫系统的状况密切相关[2]。近年来,辅助性T淋巴细胞17(Th17)/调节性T淋巴细胞(Treg)平衡在CHB患者中的研究越来越多，而对其在乙型肝炎LC中的研究却较少，本研究通过对乙型肝炎LC患者外周血Th17和Treg及其特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)和叉状头/翅膀状螺旋转录因子3(Foxp3)的检测来探讨Th17、Treg、RORγt和Foxp3在LC患者中的变化及其临床意义。

1对象与方法

1.1研究对象选取2015年7—12月昆明医科大学第一附属医院诊治的慢性HBV感染者64例，其中CHB患者21例(CHB组)、CLC患者21例(CLC组)、DCLC患者22例(DCLC组)。同期选取本院体检健康者20例为对照组。纳入标准：(1)患者在入组前半年未接受过抗病毒治疗；(2)患者均符合2015年修订的《慢性乙型肝炎防治指南》[2]和2014年制定的《乙型肝炎病毒相关性肝硬化的临床诊断、评估和抗病毒治疗的综合管理》[3]的诊断标准。排除标准：(1)其他病毒性肝炎患者；(2)酒精性肝病、自身免疫性肝病、原发性HCC等其他肝脏疾病患者；(3)其他严重的全身性疾病患者。本研究通过本院伦理委员会同意，研究对象均知情同意。

1.2方法

1.2.1一般资料收集记录研究对象性别、年龄及丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)(采用日立公司的全自动生化分析仪)。

1.2.2流式细胞术检测外周血Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值取研究对象新鲜抗凝血300 μl,加入10% 1640培养基900 μl，再向上述混合液中加入2 μl白细胞刺激剂，混匀后放入37 ℃ 5%CO2温箱培育过夜，次日取出混合液以3 000 r/min离心7 min(离心半径10.5 cm)，弃上清液后加入Fix perm室温避光保存40 min，以3 500 r/min离心6 min(离心半径10.5 cm)弃上清液后反复多次加入perm wash并以3 500 r/min离心6 min(离心半径10.5 cm)，弃上清液后使细胞充分破膜、固定、染色，再加入CD8FITC、CD3APC-H7、Foxp3PE和IL-17A等荧光抗体室温避光40 min，后进行细胞内染色，最后加入适量磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，用FACSDiva Version 6.1.3流式细胞仪检测分析Th17、Treg表达率，计算Th17/Treg比值。1.2.3实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法测定外周血RORγt、Foxp3 mRNA表达水平取外周抗凝血400 μl，加入1 200 μl红细胞裂解液混匀,4 ℃下以450 r/min离心10 min(离心半径10.5 cm)，提取外周血单个核细胞，用Trizol法从外周血单个核细胞中提取总RNA，在分光光度仪上测定RNA浓度及260、280 nm处吸光度值(A值)，以A值在1.8～2.0范围内为纯度可。严格按照反转录试剂盒(TaKaRa公司)操作说明书将RNA反转录为cDNA，再将4 μl的cDNA与SYBR Green PCR master mix混合，最后总体积为50 μl，并用TL988 RT-PCR仪进行扩增，PCR循环条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸31 s，共40个循环；最后72 ℃延伸7 min。采用2-ΔΔCT计算外周血RORγt、Foxp3 mRNA表达水平。

2结果

2.14组一般资料比较4组性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。4组年龄、ALT、AST、TBIL比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1　4组一般资料比较

注：a为χ2值，b为F值，c为H值；CHB=慢性乙型肝炎，CLC=代偿期肝硬化，DCLC=失代偿期肝硬化，ALT=丙氨酸氨基转移酶，AST=天冬氨酸氨基转移酶，TBIL=总胆红素

2.24组外周血Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值比较4组外周血Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。CHB组、CLC组、DCLC组Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；DCLC组Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值均高于CHB组，Th17表达率及Th17/Treg比值均高于CLC组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.34组外周血RORγt mRNA和Foxp3 mRNA表达水平比较4组外周血RORγt mRNA和Foxp3 mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。CHB组、CLC组、DCLC组RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；DCLC组RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平均高于CHB组、CLC组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

Table 2Comparison of the expression rates of Th17 and Treg and Th17/Treg among the 4 groups

组别例数Th17表达率(%)Treg表达率(%)Th17/Treg比值对照组202.3±1.11.6±0.81.5±0.4CHB组214.9±1.8a2.6±0.9a1.9±0.6aCLC组215.9±1.8a2.8±0.9a2.2±0.5aDCLC组227.9±2.3abc3.3±1.0ab2.5±0.7abcF值26.0879.45510.466P值<0.001<0.001<0.001

注：Th17=辅助性T淋巴细胞17，Treg=调节性T淋巴细胞；与对照组比较，aP<0.05；与CHB组比较，bP<0.05；与CLC组比较，cP<0.05

Table 3Comparison of the expressions of RORγt mRNA and Foxp3 mRNA among the 4 groups

组别例数RORγtmRNAFoxp3mRNA对照组201.8±1.10.9±0.9CHB组213.6±2.4a2.2±1.6aCLC组214.2±2.7a2.4±1.4aDCLC组226.0±2.7abc3.3±1.2abcF值8.4758.625P值<0.001<0.001

注：RORγt=维甲酸相关核孤儿受体γt,Foxp3=叉状头/翅膀状螺旋转录因子3；与对照组比较，aP<0.05；与CHB组比较，bP<0.05；与CLC组比较，cP<0.05

2.4相关性分析CHB组、CLC组、DCLC组外周血Th17表达率与RORγt mRNA表达水平均呈正相关(P<0.05)；而对照组外周血Th17表达率与RORγt mRNA表达水平无直线相关关系(P>0.05)。CHB组、CLC组、DCLC组外周血Treg表达率与Foxp3 mRNA表达水平均呈正相关(P<0.05)；而对照组外周血Treg表达率与Foxp3 mRNA表达水平无直线相关关系(P>0.05)。CHB组、CLC组、DCLC组外周血Th17表达率、RORγt mRNA表达水平与ALT呈正相关(P<0.05)；CHB组外周血Foxp3 mRNA表达水平与ALT呈正相关(P<0.05)；对照组外周血Th17、Treg表达率、RORγt mRNA表达水平、Foxp3 mRNA表达水平与ALT无直线相关关系(P>0.05)；CHB组Treg表达率、CLC组Treg表达率及Foxp3 mRNA表达水平、DCLC组Treg表达率及Foxp3 mRNA表达水平与ALT无直线相关关系(P>0.05)。CHB组RORγt mRNA表达水平、Foxp3 mRNA表达水平与AST、TBIL呈正相关(P<0.05)；CHB组Th17表达率、Treg表达率与AST、TBIL无直线相关关系(P>0.05)；对照组、CLC组、DCLC组Th17表达率、Treg表达率、RORγt mRNA表达水平、Foxp3 mRNA表达水平与AST、TBIL均无直线相关关系(P>0.05，见表4)。

表4　4组各指标相关性分析

注：a为P<0.05，-表示未做相关性分析

3讨论

慢性HBV感染可以引起自身免疫反应直接损伤肝细胞，也可通过细胞介导的细胞毒作用(ADCC)引起肝损伤。越来越多的证据表明，免疫介导的肝损伤在慢性HBV感染中发挥着重要作用，如Yang等[4]的研究提示，CHB和HBV相关的慢加急性肝衰竭患者(ACHBLF)的Th17表达率均高于乙型肝炎病毒携带者(AsC)和正常对照组，并随着AsC、CHB到ACHBLF的免疫炎症加重而逐渐增加。Feng等[5]的研究发现，在HBV感染患者中Th17、Treg表达率均高于对照组，但Th17/Treg比值却明显升高，并且还发现Th17、Treg表达率与肝功能呈正相关。Yu等[6]研究提示，与对照组相比，Treg表达率在CHB组明显增加，在LC组轻度增加，而Th17表达率在两组均显著增加；还发现在LC患者中，尤其是死亡患者中，Th17/Treg比值显著升高，并与肝功能分级和终末期肝脏疾病评分模型呈正相关。Zhai等[7]在关于肝衰竭患者的研究中也发现，死亡患者的Th17/Treg比值高于生存患者。

本研究发现，4组年龄有明显差异，考虑与入组患者疾病程度有关，符合CHB向LC发展情况。本研究还发现，CHB组、CLC组、DCLC组Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值均高于对照组，DCLC组Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值均高于CHB组，Th17表达率及Th17/Treg比值均高于CLC组；且CHB组、CLC组、DCLC组Th17表达率与ALT均呈正相关，与Feng等[5]的研究一致。Chen等[8]也发现，LC组Th17、Treg表达率均高于CHB组，以上结果表明Th17和Treg参与了HBV感染后肝脏炎性反应和肝细胞免疫清除的过程，Th17可能还与肝脏纤维化进程和肝损伤严重程度有关。本研究还发现，CHB组与CLC组Th17表达率、Treg表达率、Th17/Treg比值无明显差异，与李晨等[9]的研究结果不太一致，可能与CHB患者大多数处于肝脏炎性活动期有关。而本研究中DCLC组Th17表达率、Th17/Treg比值较CHB组、CLC组升高提示Th17对终末期肝脏疾病的肝损伤程度是一个潜在标记，高Th17/Treg比值可能对病情及预后有较好预测价值。

RORγt是促进Th17分化的最特异性转录因子[10]，而Foxp3是Treg特异性转录因子[11]。本研究发现，CHB组、CLC组、DCLC组RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平均高于对照组，DCLC组RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平均高于CHB组、CLC组，且CHB组、CLC组、DCLC组Th17表达率与RORγt mRNA表达水平、Treg表达率与Foxp3 mRNA表达水平、RORγt mRNA表达水平与ALT均呈正相关；提示RORγt mRNA与Th17，Foxp3 mRNA与Treg在HBV感染进程中变化比较一致，RORγt和Foxp3可能在HBV感染后调控Th17与Treg的分化，从而引起肝脏炎症和疾病进程。Zhang等[12]研究发现，随着肝脏炎性活动度的增加，肝组织内IL-17、RORγt mRNA表达水平均呈上升趋势，并且肝组织炎性活动度与肝脏内RORγt mRNA表达水平和血清IL-17表达水平均呈正相关。高夕雷等[13]研究发现，CHB患者Foxp3 mRNA的表达水平高于对照组，且与HBV-DNA滴度呈正相关。RORγt和Foxp3分别是Th17和Treg细胞的特异性标志物，在很大程度上控制Th17和Treg细胞功能的表达，考虑其通过诱导Th17和Treg细胞生成和分化而在HBV感染后不同阶段进行调控并发挥作用。

综上所述，CLC、DCLC和CHB患者外周血Th17和Treg表达率及其特异性转录因子RORγt和Foxp3的mRNA表达水平均比对照组高，同时3组HBV感染相关LC和CHB患者外周血Th17表达率和RORγt mRNA表达水平均与ALT水平呈正相关，在Th17表达率高于Treg表达率时，Th17/Treg平衡被打破，肝脏组织以促进炎症发展的Th17为主，从而加重肝脏损伤，但同时反馈性地引起Treg表达率增高，抑制过强的炎性反应，有利于阻止病情急剧发展，而高Th17表达率及Th17/Treg比值可能提示病情进展快、预后差，说明Th17、Treg及其特异性转录因子RORγt、Foxp3可能与乙型肝炎LC患者的疾病进展和肝功能状态有关。

本试验在以往研究基础上，进一步探索乙型肝炎LC患者不同疾病阶段Th17/Treg平衡情况及其特异性转录因子RORγt、Foxp3 mRNA表达水平的变化，并结合肝功能探讨Th17/Treg失衡的原因以及其在乙型肝炎LC患者疾病进展中的免疫学机制，为乙型肝炎LC患者的诊治和病情的预测提供新思路，进一步预防LC向晚期及HCC发展。但本研究样本量较小，Th17/Treg失衡对肝脏损伤情况与其他研究结果不完全一致，还有待于更多研究加以证实。

作者贡献：涂琛负责试验实施和论文撰写；游晶负责研究设计和实施；陈红英、洪敏、刘子杰、娄鸣负责试验实施、资料收集；刘怀鄂负责质量控制与论文结构完善及论文修改。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：李婷婷)

Changes of Th17 and Treg and the Expressions of RORγt and Foxp3 mRNA in Patients With HBV Related Liver Cirrhosis and the Clinical Significance

TUChen,YOUJing,LIUHuai-e,etal.

DepartmentofInfectiousDisease,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the changes of peripheral Th17 and Treg and the expressions of RORγt and Foxp3 mRNA in patients with HBV related liver cirrhosis and explore the clinical significance.MethodsWe enrolled 64 patients with chronic HBV in fection who received treatment in the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from July to December in 2015.Among them,21 patients with chronic hepatitis B were assigned into CHB group,21 patients at compensated liver cirrhosis were assigned into CLC group,and 22 patients at decompensated liver cirrhosis were assigned into DCLC group.20 healthy people who received physical examination in the hospital in the same period were enrolled as control group.The general data(gender,age,ALT,AST and TBIL) were collected；expression rates of Th17 and Treg in the peripheral blood of the subjects were detected using flow cytometry,and the ratio of Th17/Treg was calculated.RT-qPCR method was applied to determine the expressions of RORγt and Foxp3 mRNA of peripheral blood.ResultsThe four groups were significantly different in age,ALT,AST and TBIL(P<0.05).CHB group,CLC group and DCLC group were higher than control group in the expression rates of Th17 and Treg and Th17/Treg(P<0.05)；DCLC group was higher than CHB group in the expression rates of Th17 and Treg and Th17/Treg,and was higher than CLC group in the expression rate of Th17 and Th17/Treg(P<0.05).CHB group,CLC group and DCLC group were higher than control group in the expressions of RORγt mRNA and Foxp3 mRNA(P<0.05);DCLC group was higher than CHB and CLC group in the expressions of RORγt mRNA and Foxp3 mRNA(P<0.05).For CHB group,CLC group and DCLC group,the expression rate of Th17 was positively correlated with the expression of RORγt mRNA(P<0.05)；for CHB group,CLC group and DCLC group,the expression rate of Treg was positively correlated with the expression of Foxp3 mRNA(P<0.05);for CHB group,CLC group and DCLC group,the expression rate of Th17 and the expression of RORγt mRNA was positively correlated with ALT(P<0.05)；for CHB group,the expression of Foxp3 mRNA was positively correlated with ALT(P<0.05)；for CHB group,the expressions of RORγt mRNA and Foxp3 mRNA were positively correlated with AST and TBIL(P<0.05).ConclusionTh17 and Treg cells and their specific transcription factors RORγt and Foxp3 may be related with the progress of HBV-related liver cirrhosis and liver function.

【Key words】Hepatitis B；Liver cirrhosis；T-lymphocytes,helper；T-lymphocytes,regulatory；RORγt；Foxp3

基金项目：云南省科技计划项目(2011WS0053；2011FZ121；2012WS0028)；云南省教育厅基金项目(2013J053)

通信作者：游晶，650032 云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院感染科；E-mail:jingyoukm@126.com

【中图分类号】R 512.62 R 575.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.18.004

(收稿日期：2015-12-22；修回日期：2016-04-26)

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