新疆牛群中鹿流行性出血热血清学调查

刘 帅，张 玲，加帕尔·哈斯木，宋迎春，张志新，康京丽，薛新梅，闫 双，谷文喜，马晓菁，叶 锋，易新萍，钟 旗

（1.新疆农业大学动物医学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐830000；3.新疆尉犁县畜牧兽医工作站，新疆尉犁 841500；4.新疆巴音郭楞蒙古自治州动物疾病控制与诊断中心，新疆库尔勒 841000；5.新疆哈密地区动物疫病预防控制中心，新疆哈密 839000；6.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）



新疆牛群中鹿流行性出血热血清学调查

刘 帅1，2，张 玲1，2，加帕尔·哈斯木3，宋迎春4，张志新5，康京丽6，薛新梅4，闫 双2，谷文喜2，马晓菁2，叶 锋2，易新萍2，钟 旗2

（1.新疆农业大学动物医学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐830000；3.新疆尉犁县畜牧兽医工作站，新疆尉犁 841500；4.新疆巴音郭楞蒙古自治州动物疾病控制与诊断中心，新疆库尔勒 841000；5.新疆哈密地区动物疫病预防控制中心，新疆哈密 839000；6.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

摘 要：本研究采用鹿流行性出血热（EHD）cELISA诊断试剂盒分别对2014年和2015年6、7月份从新疆10个地（州、市）随机采集的662份牛血清进行了EHD检测。结果检出阳性48份，阳性率为7.25 %；检出地区有：哈密市、巴里坤县、伊吾县、尉犁县、岳普湖县，其中哈密市和岳普湖县的阳性率较高，在20% 左右。这是首次对新疆部分地区进行EHD血清学调查，检测结果为今后新疆地区的EHD研究，特别是病原学方面研究提供了科学依据。

关键词：鹿流行性出血热；牛；cELISA；新疆

鹿流行性出血热（Epizootic hemorrhagic disease of deer，EHD）是流行性出血热病毒（Epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV）以库蠓为传播媒介，引起鹿（尤其是白尾鹿）、牛、羊等多种反刍动物体温升高、厌食、黏膜和浆膜面广泛出血，有时引起孕畜流产和休克致死的一种严重传染病[1]。EHDV属于呼肠孤病毒科环状病毒属，与蓝舌病病毒有一定的亲缘关系。该病于1955年首次在美国东部被发现，之后加拿大、尼日利亚、澳大利亚、菲律宾、留尼汪岛、日本等[2-4]国家或地区相继报道有EHDV存在。我国部分省份也在牛、羊血清中检测到EHDV抗体，甚至成功从牛的抗凝血中分离到EHDV毒株[5]。新疆属于温带大陆性干旱气候，温度、湿度、光照、水源等条件均适于该病传播媒介库蠓的栖息繁衍。自1990年新疆首次分离到蓝舌病毒后，2014年王玉[6]也从尉犁县监控牛群中分离到了蓝舌病毒，证实了库蠓媒介病毒病在新疆长期存在。这给新疆畜牧业带来了巨大的潜在威胁，因此EHD的调查研究对新疆畜牧业的发展具有重要意义。本研究通过对在2014年和2015年从新疆部分地区随机采集的牛血清进行EHD抗体检测，来初步探查目前新疆EHD的流行情况。

1　材料

分别在2014年和2015年的6、7月份，从新疆乌鲁木齐、巴州、哈密等10个地（州、市）随机采集牛血清662份；鹿流行性出血热病毒抗体检测试剂盒（EHD cELISA），由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室提供。其他仪器还有Biorad 680酶标仪、96孔酶标板等。

2　方法

严格按照鹿流行性出血热病毒抗体检测试剂盒（EHD cELISA）说明书操作：统计样品数量，确定所需EHDV抗原包被ELISA板（条）的数量，待测样品、阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、空白对照应分别测量2孔；在抗原包被 ELISA板中加入40 μL稀释液，随后按每孔10 μL加入待测样品和对照，充分震荡混匀，在37 ℃温箱温育30 min；用稀释液配制竞争抗体工作液，每孔加50 μL，充分震荡，在37 ℃温箱温育30 min；倒掉酶标板里的液体，拍干，配制HPR酶标二抗，每孔加入50 μL，震荡，37 ℃温箱温育30 min；用PBST洗板5次，拍干；每孔加50 μL TMB液，显色（15± 2）min；快速按每孔50 μL 加入终止液，用酶标仪450 nm波长测定吸光值。

计算抑制率、弱阳性上限和下限值，再据此做出阴、阳性判定（如果被检样品的抑制率大于或等于弱阳性上限值，该样品就可以被判为阳性；如果被检样品的抑制率小于或等于弱阳性下限值，该样品就可以被判为阴性；如果被检测样品的抑制率在弱阳性上限和下限之间，暂定为可疑，重复试验，如果结果相同，则判为弱阳性，还可过一段时间后重新从动物取样再进行检测）。

3　结果

3.1部分EHD cELISA检测结果（吸光值、抑制率）

如表1所示，该96孔酶标板中：阴性对照平均A值为 1.0575 ，弱阳性对照抑制率（PI）为65.34% ；弱阳性上限值为 71.87 %，弱阳性下限值为 58.81 %；检测样品 YL 8 和 YL 32 的抑制率（PI）分别为73.72 % 和 72.86 %，均大于弱阳性上限值，判为阳性。样品 YL 26 的抑制率（PI）为 62.41 %，介于弱阳性上限值和下限值之间，暂定为可疑样品。再根据重复试验结果，做出判定。

3.2检测结果汇总

新疆部分地区 662份牛血清EHDV抗体检测统计结果见表2。哈密市、巴里坤县、伊吾县、尉犁县、岳普湖县检测出EHDV阳性抗体共48份，平均阳性率为7.25 %，其中哈密市和岳普湖县牛的感染率较高，分别为21.11 % 和20 %。其余市（县、区）未检测出EHDV抗体。662份样品采集地点分布如图1所示，红色标记为检出EHD阳性样品地区，蓝色标记为EHD阴性地区。

3.3伊吾县、尉犁县样品检测结果

如表3所示，2014年6月在伊吾县随机采样90份，检出EHDV抗体阳性17份，阳性率为18.89 %；2015年6月随机采样41份，未检出EHDV抗体。2014年6月在尉犁县随机采样50份，检出EHDV抗体9份，阳性率为18.00 %；2015 年6月随机采样30份，未检测到EHDV抗体（2014年与2015年采样动物耳号不同，无重复采样）。

表1　部分牛血清 EHD cELISA检测结果（尉犁县 44份）

表2　新疆部分地区牛EHD cELISA 检测结果

图1　样品采集地点示意图

表3　伊吾县、尉犁县样品检测结果统计

4　讨论

本研究针对新疆10个地（州）的20个县（市、区）共计662头牛进行了EHD cELISA检测，其中阳性48份、阴性614份，平均阳性率为7.25 %。巴里坤县、伊吾县、哈密市、尉犁县、岳普湖县均有不同程度的牛EHDV感染，阳性率分别为1.11%、12.98%、21.11%、11.25 %、20.00 %。而其它地区样品未能检测出EHDV抗体，可能与这些地区气候、地理条件，如温度、水泊、风力、气压等因素不利于EHDV传播媒介库蠓的生长繁殖，或是检测样品数量偏少有关。

检出的48份阳性样品均采自2014年6、7月，2015年样品全为阴性。其中伊吾县和尉犁县两年都有采集样品，2014年样品阳性率达到18.00 %，而2015年在相同地点、不同编号牛采集的血清中，未能检测到EHDV抗体。新疆地区2015年天气变化异常：春季、夏季区域性暴雨和局地强对流天气多发，南北疆频遭风沙袭击；气温升降频率快，极端性强，遭遇了历史罕见高温天气过程，接着寒潮又至；气象灾害多发，暴雨洪涝灾害损失居历史同期第二位。这些极端自然事件的多发，严重影响了库蠓的生存繁殖，导致EHD感染率出现暂时性下降。

鹿流行性出血热是我国规定的进境动物检疫二类疫病。EHDV与蓝舌病病毒高度相似，传播媒介同为库蠓。EHDV不同血清型的毒力有差异，同一血清型的毒力每年也在不断的变化。有时牛感染后可以检测到抗体，但不表现临床症状[7]。疾病暴发区的动物病死率可高达30%。该病目前尚无有效的疫苗和治疗方法，暴发流行时会给畜牧业和国家贸易带来巨大损失[8]。

新疆深居内陆，远离海洋，属温带大陆性气候，昼夜温差大，日照时间长，阿尔泰山、天山、昆仑山的积雪、冰川孕育汇集了500多条河流湖泊，分布于天山南北盆地，加上有大量牛、羊等易感动物的存在，这为库蠓的繁衍、疾病的传播等形成了有利条件。

库蠓种类繁多，常孽生水塘、沼泽、树洞、石穴的积水及荫蔽的潮湿土壤，在夏季日出和日落时活动最为频繁，对水源、湿度、温度、光照、风等有一定的要求。EHD的流行分布情况与其媒介库蠓的活动情况呈正相关，主要分布在北纬40度和南纬45度之间。本次实验结果也印证了这一点，但随着全球气候变暖，该范围有扩大趋势。

当血液中出现EHDV中和抗体时（约于感染后6～8天），病毒血症消失，所以抗体转阳前2周是EHDV分离的关键时间点。可以在EHDV抗体阳性率较高的地区设立EHDV抗体阴性动物作为监控群，取抗体转阳前后2周内的红细胞接种于BHK-21细胞来分离EHDV。该方法虽费时费力，但可大大提高病毒分离的成功率。也可采用库蠓组织研磨液接种细胞的方法来分离EHDV。

本研究首次对新疆部分地区牛群中的鹿流行性出血热进行了血清学调查，检测结果表明新疆部分地区存在牛的鹿流行性出血热感染。本研究结论为今后新疆地区鹿流行性出血热的研究，特别是病原学研究方面提供了科学依据。

参考文献：

[1] Aradaib I，Ali N. Current status and future prospects of epizootic haemorrhagic disease of deer -a review [J]. Veterinarski Arhiv，2004，74（1）：63-83.

[2] 陈志飞，李树清. 鹿流行性出血热病毒[J]. 中国进出境动植检，1996（4）：31-33.

[3] Catherine C S，Matthieu R，Corinne S，et al. Epizootic haemorrhagic disease virus in Reunion Island: Evidence for the circulation of a new serotype and associated risk factors [J]. Veterinary Microbiology，2014，170（3-4）：383-393.

[4] Campbell C H，StGeorge T D. A preliminary report of a comparison of epizootic haemorrhagic disease viruses from Australia with others from North America，Japan and Nigeria [J]. Aust Vet J，1986，63（7）：233.

[5] 曹颖颖，吴健敏，林俊，等.广西首例牛源鹿流行性出血热病毒的分离鉴定 [J]. 中国预防兽医学报，2015 （10）：746-750.

[6] 王玉. 新疆部分地区蓝舌病流行病学调查及其毒株的初步分离鉴定[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2014.

[7] 江海天，杨云庆，艾军，等. 鹿流行性出血病病毒实时荧光PCR检测方法的初步建立[J].云南畜牧兽医，2014（5）：1-6.

[8] Temizel E M，Yesilbag K，Batten C，et al. Epizootic hemorrhagic disease in cattle，Western Turkey [J]. Emerg Infect Dis，2009，15（2）：317-319.

（责任编辑：朱迪国）

中图分类号：S851.3 文献识别码：A

文章编号：1005-944X（2016）04-0015-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.04.005

基金项目：公益性行业（农业）科研专项“重要牛羊虫媒病毒病防控关键技术研究与应用”项目（201303035）；新疆农业大学产学研联合培养研究生项目（xjaucxyyjs-20151019）

通讯作者：钟旗

Serological Survey on Deer Epizootic Hemorrhagic Disease of Bovine in Xinjiang

Liu Shuai1，2，Zhang Ling1，2，Jiapaer Hasimu3，Song Yingchun4，Zhang Zhixin5，Kang Jingli6，Xue Xinmei4，Yan Shuang2，Gu Wenxi2，Ma Xiaojing2，Ye Feng2， Yi Xinping2，Zhong Qi2
（1. College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052；2. Institute of Veterinary Medicine，Xinjiang Acadamy of Animal Science，Urumqi，Xinjiang 830000；3. Yuli Animal Husbandry and Veterinary Station，Yuli，Xinjiang 841500；4. Animal Eppidemic Control and Diagnosis Center of Bayingol Mongolian Autonomous Prefecture，Korla，Xinjiang 841000；5. Animal Eppidemic Control and Diagnosis Center of Hami Prefecture，Kumul，Xinjiang 839000；6.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：This study was conducted by cELISA kits of epizootic hemorrhagic disease（EHD）on 662 bovine serum collected from 10 districts of Xinjiang area in the Summer of 2014 and 2015 to make a bovine serosurvey of EHD in Xinjiang. 48 samples from Hami，Balikun，Yiwu，Yuli and Yuepuhu were serology positive， with an average rate of 7.25%. The seroprevalence of bovine in Hami and Yuepuhu （about 20%）were obviously higher than others. This study was the fi rst serosurvey of EHD in Xinjiang，and indicated that EHD infection existed in parts of Xinjiang. The results provided a scientifi c basis for EHD future study，especially for its etiology research in Xinjiang area.

Key words：EHD；bovine；cELISA；Xinjiang