洋葱内生菌的筛选及其次级代谢产物分析

邓振山，何　园，李　超

（1.延安大学生命科学学院，陕西 延安 716000；2.石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003）



洋葱内生菌的筛选及其次级代谢产物分析

邓振山1，何园2，李超2

（1.延安大学生命科学学院，陕西 延安 716000；2.石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003）

摘 要：通过组织块分离法、梯度稀释涂布法和划线分离法，从健康紫皮和白皮洋葱中筛选得到内生菌，采用平板对峙培养法测定其对 10株供试指示菌的抑菌活性，再以洋葱提取液为对照，对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析和高效液相色谱分析。结果表明，从2种洋葱中共筛选出87株内生菌，其中内生细菌68株，内生放线菌3株，内生真菌16株。通过抑菌试验，发现12株内生细菌对3至9种指示菌具有抑菌活性，占分离菌株总菌数的23.08％，其中YD–21、YD–23、YD–26、YD–27、YD–32、YD–38、YD–37、YD–22共8株菌株的抗菌谱较广，对9种供试指示菌均具有抑菌活性。薄层层析检测结果表明，菌株YD–27发酵产物在Rf值为0.73处有与洋葱提取液层析带迁移率相同的显色带，液相色谱分析结果表明其属于黄酮类物质。菌株 YD–27能发酵产生黄酮类或产生与黄酮类类似的化合物，表明洋葱内生菌具有合成黄酮类次级代谢产物药物的潜力。

关 键 词：洋葱；内生菌；抑菌活性；薄层层析；黄酮类

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内生菌（Endophyte）是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，但不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物，包括内生细菌、内生放线菌和内生真菌［1］。自1993 年Stierle等［2］从短叶紫杉中发现产紫杉醇的内生真菌后，有关内生菌的研究越来越受到人们关注。内生菌广泛存在于绝大多数植物中，有着丰富的生物多样性和活性多样性，其开发与应用潜力巨大［3–4］。从植物内生菌分离到的活性物质中约有38％是未知的新化合物，大约有51％是未知的新化合物；从土壤微生物中分离的新化合物中只占其总数的38％［5］。与从植物中提取到的活性物质相比，微生物具有生长繁殖快、发酵成本低、易培养、易控制、不受气候与地域等自然条件限制和易于通过现代生物技术改造其遗传性状等优点，对保护药材资源和保证药物供应等具有重要意义［6］，因此，植物内生菌已成为发现、开发和利用新活性化合物的重要来源。

洋葱（Allium cepa Linn.） 属百合科（Liliaceae）葱属草本植物，有降血压、抗动脉硬化、预防血栓、降低血糖含量、治疗糖尿病、预防骨质疏松等作用。洋葱含抗菌、抗炎物质［7］，含挥发油、硫化物、类黄酮、甾体皂甙类和前列腺素类等化学成分，有多种药用价值［8］。目前关于用化学方法和物理方法提取洋葱中药用成分的报道较多，但国内外关于通过洋葱内生菌发酵来获得有价值代谢产物的报道尚少。笔者从洋葱中分离、筛选出具有抑菌活性的菌株，并对其次级代谢产物进行研究与分析，以期为新型微生物药物的开发和利用提供新的研究途径和良好的种质资源。

1 材料和方法

1. 1 材料

1.1.1 供试样品

洋葱（Allium cepa Linn.）为大宝黄皮的白皮洋葱和宏富紫皮洋葱2个品种。

1.1.2 供试指示菌菌株

指示菌均来自延安大学生命科学学院，由微生物实验室鉴定并保藏。供试指示菌菌株信息见表1。

表1　供试指示菌Table 1 Indicator microbes in inhibitory test

1.1.3 供试培养基

固体分离培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、高氏I号培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）、豆芽汁葡萄糖培养基、水琼脂培养基、孟加拉红培养基、I型改良培养基和II型改良培养基。

I型改良培养基分为改良固体PDA培养基、改良孟加拉红培养基和改良牛肉膏蛋白胨培养基。改良固体PDA培养基是在PDA培养基中加入20％的洋葱浸汁（体积比）；改良孟加拉红培养基是在孟加拉红培养基中加入20％洋葱浸汁（体积比）；改良牛肉膏蛋白胨培养基是在牛肉膏蛋白胨培养基中加入20％洋葱浸汁（体积比）［9］。

Ⅱ型改良培养基分为2种：在PDA培养基中加入丙酮酸钠（0.01 g/（100 mL））；将PDA培养基灭菌后，在临用前分别加入0.03％青霉素和链霉素稀释液各100 mL，使每1 mL培养基中含青霉素和链霉素各30 μg［10］。

在PDA培养基中不加琼脂即得液体培养基。300 mL三角瓶中装液量为150 mL培养基时均需1×105Pa灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 洋葱内生菌的分离与纯化

采用组织块分离法［11–12］和梯度稀释涂布法［13］分离出内生菌，并初步进行菌落形态学描述、分类和编号，于4 ℃冰箱斜面保存，备用。以上操作均在无菌环境下进行。

1.2.2 内生菌体外抑菌活性的测定

采用平板对峙培养法测定按上述方法分离得到的内生菌的抑菌活性，并计算抑菌率［14］。

1.2.3 菌株液体发酵及发酵产物的提取

选取抑菌效果比较明显的 12株洋葱内生菌菌株，从斜面挑取纯化菌种接种于 PDA平板上，活化2～3 d，待其生长旺盛后，用接种环挑取2～3环菌，分别接种于装有相应液体发酵培养基的三角瓶中，置于恒温摇床上振荡培养，发酵温度（28±1） ℃，摇床转速为220 r/min，振荡培养时间为4～5 d。 将内生菌发酵产物用 16层纱布过滤，得到菌体和发酵液，将过滤得到的菌体采用甲醇超声浸提，过滤收集浸提液，合并过滤的发酵液和浸提液，再用2层滤纸和脱脂棉进行抽滤，然后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，于旋转蒸发仪中减压浓缩至5 mL左右，再用5 mL甲醇溶解，所得液体经0.22 μm的微孔滤膜过滤，并于4 ℃冰箱保存，备用［15］。

1.2.4 洋葱有效成分的提取

取新鲜洋葱，烘干，粉碎，过孔径0.25 mm的筛子，制得洋葱粉末。称取洋葱粉末6 g，每次加入90 mL石油醚进行脱脂，共脱脂3次，待石油醚挥发完后，加80 mL 95％的乙醇超声波提取2.5 h，抽滤。滤渣中再加80 mL 95％的乙醇超声波提取2.5 h，抽滤。将2次的滤液合并，减压回收乙醇至滤液仅剩5～7 mL为止，置于100 mL容量瓶中，用60％乙醇稀释至刻度，得样品液［16–17］。

1.2.5 样品的薄层层析（TLC）分析

对上述分离得到的样品进行薄层层析（TLC）分析，展开剂为氯仿–甲醇（体积比8.5∶1.5），显色剂为1％三氯化铝溶液，分别观察样品在可见光和紫外光下的颜色［18］。

1.2.6 洋葱提取液与菌株发酵液的高效液相色谱分析

分别取2 mL洋葱提取液和菌株YD–27的发酵液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱（HPLC）分析。HPLC分析检测条件：色谱柱为CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇–水（体积比42∶58）；流速为1.0 mL/min；检测波长为370 nm；进样体积为10 μL；柱温为30 °C［19］。

1.2.7 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 19进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 洋葱内生菌的分离结果

从白皮洋葱和紫皮洋葱中共分离得到 87株内生菌，其中从白皮洋葱中分离到38株菌株（从外到内第1、第2、第3、第4、第5层中分别分离获得14、11、7、4、2株）；从紫皮洋葱中得到49株菌株（从外到内的第1、第2、第3、第4、第5层中分别分离得到了17、14、9、6、3株），可见，洋葱最外层的内生菌数量和种类最多，且均随层数增加呈递减趋势，紫皮洋葱中各种类内生菌的数量明显比白皮洋葱的多。

2.2 抑菌活性的测定结果

抑菌活性试验结果表明，87株内生菌中有12株至少能对3种或3种以上的指示菌菌株产生抑菌活性（表2），其中，菌株YD–22、YD–23、YD–32 和YD–37对所有指示菌菌株均有抑菌效果，占分离总菌数的 7.69％；除小麦赤霉病菌外，菌株YD–27、YD–21、YD–26对其余 9种指示菌均有抑菌活性；除对黄瓜枯萎病菌和小麦赤霉病菌外，菌株 YD–38对其余 8种指示菌均有抑菌活性（图1）；YD–45、YD–42和YD–24的抗菌谱为4种或5种；YD–13的抗菌谱为3种（表2）。总体而言，YD–22、YD–23、YD–32、YD–37、YD–27、YD–21、YD–26和YD–38 这8种内生菌均具有较广的抗菌谱（表3和图2），它们占分离总菌数的15.38％，其中YD–23对苹果炭疽病菌的抑菌率达（83.02±0.57）％（表3），且其拮抗活性最强，故选取YD–23作为后续研究的供试菌株。

表2　12 株内生菌对指示菌抑菌活性的测定结果Table 2 Inhibitory activity of 12 endophytes on the indicator microbes

表3　8株内生菌对病原真菌的抑菌率Table 3 Antifungal activity of the 8 strains of endophyte

图1　YD–27和YD–38 的拮抗谱测定结果Fig.1 Results of antagonistic spectrum on YD–27 and YD–38

图2　8株拮抗菌的平板拮抗活性Fig.2 Antagonistic activities of the eight strains in plate

2.3 薄层层析（TLC）分析结果

薄层层析（TLC）检测结果表明，菌株YD–27的发酵液和洋葱提取液在0.73处具有相同的迁移率（Rf），而且菌株YD–27的发酵产物与洋葱提取液均出现淡黄色黄酮类物质的特征性颜色反应显色斑，由紫外光下的显色反应结果可进一步确定YD–27菌株的发酵物中含有与洋葱提取液同样的化学成分，且均为黄酮类物质（表4）。

表4　内生菌YD–27发酵液与提取液的相对迁移率Table 4 Comparison the Rfvalue from metabolites and extracts of YD–27

2.4 高效液相色谱（HPLC）分析结果

发酵产物的HPLC 图谱显示，洋葱提取液在保留时间9.698 min处有一主要吸收峰（图3）；菌株YD–27的发酵液产物在保留时间9.918 min处有一主要吸收峰（图4），可以看出，这2种物质的保留时间相近，初步确定该菌株能够发酵产生与洋葱提取液成分相同的黄酮类物质。

图3　洋葱提取液液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram from extracts

图4　菌株 YD–27发酵液样品液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram from metabolites of YD–27

3 结论与讨论

本研究结果表明：2个品种洋葱中内生菌的数量和种类不同，且同一品种洋葱鳞茎不同层的内生菌分布也有差异。这与黎万奎等［20］的报道是一致的，即内生菌的分布与其宿主植物本身相关。药用植物内生菌可产黄酮类物质［6，18］。本研究中发现菌株YD–27也具有产黄酮类物质或产黄酮类物质相似物的能力。本试验中发现紫皮洋葱中的内生菌菌株数比白皮洋葱中的多，洋葱外层中的菌株数比内层中的多。经高效液相色谱法分析，洋葱提取液在370 nm处有特异吸收峰，这与洋葱提取液中含有黄酮类物质的结论［19］是一致的。YD–27发酵产物在370 nm处也有特异吸收峰，且保留时间为9.918 min，该保留时间与洋葱提取液的保留时间9.698 min相近，所以，可推测洋葱内生菌有产生黄酮类物质或产黄酮类物质相似物的能力。菌株YD–27发酵液中的次级代谢产物并非只有黄酮类化合物，故仍需进一步对其进行提取、纯化和鉴定。

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责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

Endophyte segregation from Allium cepa Linn and analysis on its secondary metabolites

Deng Zhenshan1， He Yuan2， Li Chao2
（1.College of Life Sciences， Yan’an University， Yan'an， Shaanxi 716000， China； 2.College of Life Sciences， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832003， China）

Abstract:The experiment was conducted to study the secondary metabolites of endophytic bacteria from onion by adopting purple and white onions as materials， endophytes were isolated by approaches of tissue separation， point sample of gradient dilution and streak plate， then they were screened and tested on the bacteriostatic activity by adopting indicators of 10 strains from face-to-face cultivation in PDA media. The fermentation liquor of antagonistic strain was detected using thin layer， chromatography（TLC） and high performance liquid chromatography （HPLC） by adopting onion extracts as control. A total number of 87 strains of endophytes were isolated from two onion species， including 68 strains of endophytic bacteria， 3 strains of endophytic actinomycetes， and 16 strains of endophytic fungi. Among of them， 12 strains had obvious antagonistic activity against 3 to 9 plant pathogens， accounting for 23.08％ of the total， and 8 strains （YD–21， YD–23， YD–26， YD–27， YD–32， YD–38， YD–37， YD–22） had a broad antibacterial spectrum and antibacterial activity against 9 strains of indicator microbes. Results from the analysis of TLC and HPLC showed that liquor in YD–27 strain fermentation had Rfvalue of 0.73， similar to that of flavonoids extracts form onions. The strain of YD–27 could produce flavonoids or similar compounds， which showed that the endophytes had the potential ability to produce new drugs of flavonoids.

Keywords:onions； endophyte； antibacterial activity； flavonoids compounds； flavonoids

中图分类号：Q935

文献标志码：A

文章编号：1007−1032（2016）03−0268−06

收稿日期：2015–07–17 修回日期：2016–03–21

基金项目：延安市科技局重大专项（2014CGZH–06）；陕西省科技惠民计划项目（2014HM–14）；陕西省科技统筹创新工程项目（2012KTZB03–02–03，2012CGX7，2016TTC–N–3–1）

作者简介：邓振山（1969—），男，陕西黄陵县人，博士，副教授，主要从事植物内生菌资源开发和利用及环境微生物研究，zhenshandeng214@163.com