Foxp3基因多态性与广东地区产后抑郁相关性的初步探讨*

冯桂玲，潘昆贻，邓小燕△

(1.广州医科大学附属第二医院检验科　510260；2.中山大学孙逸仙纪念医院，广东中山 510235)

·论著·

Foxp3基因多态性与广东地区产后抑郁相关性的初步探讨*

冯桂玲1，潘昆贻2，邓小燕1△

(1.广州医科大学附属第二医院检验科510260；2.中山大学孙逸仙纪念医院，广东中山 510235)

目的探讨中国广东地区女性叉头状螺旋转录因子3(Foxp3)-6054(deletion/ATT，rs5902434)、Foxp3-3279(A/C,rs376158)、Foxp3-924(A/G,rs2232365)与产后抑郁症(PPD)发病的相关性。方法用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)分析法对69例PPD确诊患者(PPD组)和140例健康产后女性(对照组)的外周血提取DNA样本，进行Foxp3-6054、Foxp3-3279、Foxp3-924点突变分析，比较两群体该基因多态性的差异。结果Foxp3基因Foxp3-6054位点在PPD组AA基因型频率和对照组间差异有统计学意义(P<0.05)，Foxp3-6054位点等位基因频率、Foxp3-3279、Foxp3-924位点单核苷酸多态性基因型频率和等位基因频率在PPD组和对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论中国广东地区Foxp3-6054与PPD的发病具有一定的相关性，中国广东地区Foxp3-3279、Foxp3-924与PPD的发病未发现相关性。

叉头状螺旋转录因子3；单核苷酸多态性；产后抑郁

产后抑郁症(PPD)被世界卫生组织(WHO)和美国精神病协会定义为产后4～6周内第一次发病(既往无精神障碍史)，症状类似普通抑郁，严重影响产妇身心健康的产褥期精神综合征。近年来，有关PPD和免疫系统的相互作用逐步受到重视，抑郁症一方面可引起各种躯体疾病相关的免疫改变；另一方面，免疫炎症也是抑郁症的发病机制之一[1]。许多研究表明调节性T细胞(Treg)在抑郁症的发生、发展中起重要作用，而叉头状螺旋转录因子3(Foxp3)可特异表达于CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)亚群上，是其获得免疫调节特性的关键转录因子，该基因的正常表达是CD4+CD25+Treg发挥作用的前提[2-3]。关于PPD与Foxp3基因多态性的相关研究少有报道。因此，本课题组试图探讨Foxp3基因的突变是否与 PPD的发生有关，通过查阅文献，可发现Foxp3-6054(deletion/ATT，rs5902434)、Foxp3-3279(A/C,rs376158)和Foxp3-924(A/G,rs2232365)这3个基因单核苷酸多态性位点的突变与银屑病等疾病的发生相关[4]。因此，本研究选取Foxp3上述3个基因单核苷酸多态性位点来研究其与 PPD的相关性，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料随机选择2013年6月至2014年9月在广东省越秀区诗书街社区医疗中心的产后回访产妇进行爱丁堡 PPD症评估量表(EPDS)调查。并根据EPDS诊断标准，大于或等于10分提示存在不同程度的抑郁症状，则视为筛查阳性，共筛选出35例PPD患者，总分越高，抑郁程度越高[5]，另34例来自广州市脑科医院确诊为PPD患者，共69例PPD患者纳入PPD组。对照组为140例足月产妇，平均年龄(29.4±4.6)岁，均为广东籍贯汉族人，既往无精神障碍史，无原发性高血压、心血管疾病、肝肾疾病、糖尿病等病史。产妇分别采集所有研究对象清晨空腹静脉采血2～3 mL，以乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝，保存于4 ℃冰箱中备用，用于基因组DNA抽提。

1.2仪器与试剂Taq DNA聚合酶、饱和酚、LadderⅠ、0.5 g/mL 溴化乙啶(EB)为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品，引物由生工生物(上海)有限公司合成[6]。仪器为PC480热循环PCR分析仪和数字凝胶成像分析仪。Foxp3基因特异性引物序列为如下。Foxp3-6054，F1：5′-ACC TTT AAG TCT TCT GCC ATT TAT TCT ATT ATT T-3′;F2：5′-CCT TTA AGT CTT CTG CCA TTT ATT CTA TTA TTA-3′;R：5′-TGA TTA TCA GCG CAC ACA CTC AT-3′。Foxp3-3279,F1：5′-CTG GCT CTC TCC CCA ACT GA-3′；F2：5′-TGG CTC TCT CCC CAA CTG C-3′;R：5′-ACA GAG CCC ATC ATC AGA CTC TCT A-3′。Foxp3-924，F1：5′-CCC AGC TCA AGA GAC CCC A-3′；R1：5′-GGG CTA GTG AGG AGG CTA TTG TAA C-3′；F2：5′-CCA GCT CAA GAG ACC CCG-3′；R2：5′-GCT ATT GTA ACA GTC CTG GCA AGT G-3′。

1.3方法

1.3.1基因组DNA的抽提按照Gentra公司的苯酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。

1.3.2Foxp3基因三位点多态性检测根据设计的Foxp3基因特异性引物，用聚合酶链反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)检测3个等位基因。PCR反应体系为：DNA 2.5 μL,加入10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，20 μmol/L 的上下游引物各1.0 μL，5×106μ/L Taq DNA聚合酶1.0 μL，灭菌双蒸水将反应体系补足至25 μL。TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice型PCR仪进行扩增。扩增条件为：Foxp3-6054，预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s；共35个循环，最后延伸7 min。Foxp3-3279/Foxp3-924，预变性96 ℃ 5 min；变性96 ℃ 20 s,退火70 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 25 s，5个循环；变性96 ℃ 25 s，退火65 ℃ 50 s，延伸72 ℃ 50 s，25个循环；变性96 ℃ 30 s，退火55 ℃ 60 s，延伸72 ℃ 90 s，5个循环；最后延伸5 min。PCR 产物行2.0%的琼脂糖凝胶(含 0.5 g/mL EB，100∶5)，取 9 μL扩增产物与1 μL溴酚蓝缓冲液混匀后加样于 0.5×TBE 缓冲液中，180伏电泳约22 min，在紫外凝胶分析系统中观察扩增条带并照相。

1.4统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行数据处理及统计分析。用基因计数法计算基因型和等位基因频率，等位基因频率=(2×纯合子数+杂合子数)/(2×受检人数)，用Hardy-Weinberg检测样本是否符合孟德尔遗传规律；基因型和等位基因频率差异比较分别采用χ2检测，以P<0.05为差异有统计学意义(双侧检验)。

2结果

2.1Hardy-Weinberg遗传平衡检验在Hardy-Weinberg遗传平衡定律中，如P<0.05，则样本人群该基因频率不符合遗传平衡法则；如P>0.05，则样本人群该基因频率符合遗传平衡法则，具有恒定性。首先对 PPD组及对照组 Foxp3基因型分布进行检验，统计PPD组和对照组不同位点基因型并用Hardy-Weinberg平衡原理估测样本的群体代表性，本组研究对象检验结果为:SNP-6054χ2=1.58；SNP-3279χ2=1.21；SNP-924χ2=2.57,显示PPD组基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)，说明研究对象所在人群实际基因频率和期望基因频率的差异不明显，其分布均符合Hardy-Weinberg 遗传遗传平衡，具有群体代表性。

表1　Foxp3基因3个SNP位点Hardy-Weinberg平衡检验

2.2Foxp3基因多态性检测结果

2.2.1Foxp3-6054位点多态性检测TT基因型只可见T组引物扩增PCR产物条带，为del/del纯合子；AA(ATT/ATT)基因型只可见A 组引物扩增PCR产物条带，为ATT/ATT纯合子；TA基因型可见T组A组两组引物扩增 PCR 产物条带，为del/ATT杂合子。见图1-A。

2.2.2Foxp3-3279位点多态性检测CC基因型只可见C组引物扩增PCR产物条带，CC为CC纯合子；AA基因型只可见A组引物扩增 PCR产物条带，AA为AA纯合子；AC 基因型可见C组 A 组两组引物扩增PCR产物条带，AC为AC杂合子。见图1-B。

2.2.3Foxp3-924位点多态性检测AA基因型只可见A组引物扩增PCR产物条带，AA为AA纯合子；GG基因型只可见G组引物扩增PCR产物条带，GG为GG纯合子；GA基因型可见G组A组两组引物扩增 PCR产物条带，GA为GA杂合子。见图1-C。

注：M为标准参照物DL600 bp。

图1Foxp3-6054、Foxp3-3279和Foxp3-924位点

基因型PCR-SSP分析电泳

2.3重复性实验随机选取10%的样本进行重复性实验，结果与之前实验结果符合率为100%。

2.4基因型及等位基因分布频率

2.4.1Foxp3-6054位点多态性基因型及等位基因分布频率Foxp3-6054位点ATT插入型等位基因频率在 PPD组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。TT、TA和AA 3种基因型频率在PPD患者中分别占39.1%、50.7%和10.1%；在对照组中分别占34.3%、64.3%和1.4%。两组间TT基因型和TA基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，而AA基因型频率明显高于对照组(P<0.05)。两组间T等位基因和A等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　Foxp3-6054位点多态性基因型及等位基因在

2.4.2Foxp3-3279位点多态性基因型及等位基因分布频率Foxp3-3279位点A等位基因频率在 PPD组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。AA、AC和CC 3种基因型频率在 PPD患者中分别为8.7%、23.2%和68.1%；在对照组中分别为5.0%、36.4%和58.6%。3种基因型频率在 PPD组和对照组的分布差异无统计学意义(P>0.05)。两组间等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　Foxp3-3279位点多态性基因型及等位基因在

2.4.3Foxp3-924位点多态性基因型及等位基因分布频率Foxp3-924位点G等位基因频率在 PPD患者和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。AA、AG和GG 3种基因型频率在 PPD患者中分别占39.1%、39.1%和21.7%；在健康对照中分别占36.4%、45.0%和18.6%。3种基因型频率在 PPD患者和对照组的分布差异无统计学意义(P>0.05)。两组间等位基因频率，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3　Foxp3-924位点多态性基因型及等位基因在人群中

3讨论

PPD属于神经症性抑郁症，目前对抑郁发病机制的研究证实，抑郁症并不是由单一的神经递质失衡引起，而是受多因素影响。研究显示抑郁症患者体内炎症前细胞因子、急性期反应蛋白、化学增活素及细胞黏附分子等水平明显升高，影响抑郁症的特征性改变，如神经递质代谢、神经内分泌的改变和突出可塑性改变等，证实炎性反应在抑郁症的发生、发展中起重要作用。近几年，许多临床和动物实验研究表明大部分抑郁症的患者存在免疫系统激活的表现，如在给予细胞因子治疗的非抑郁症患者可以出现抑郁行为，一些患有免疫功能异常的自身免疫性疾病患者易出现抑郁行为，某些细胞因子可以激活下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)，可以使中枢肾上腺系统功能亢进，或者导致血清素系统的活化，引起抑郁症的相关血液生化改变[1]。由此可见，免疫调节的失衡是PPD的发病机制之一。

人类Foxp3基因定位于XP11.23，含有11个外显子和10个内含子，其cDNA全长1 869 bp，表达于CD4+CD25+Treg，目前大多数学者认为Foxp3可作为CD4+CD25+Treg特异性标志物，而Treg是T细胞的一个亚群，对免疫反应具有抑制效应[6]。目前在其他免疫紊乱的疾病中，有关Treg的研究很多，而对于存在免疫失衡的抑郁症Treg的作用研究较少。鉴于Treg广泛的免疫调节作用，同时考虑到抑郁症患者体内存在明显的免疫功能紊乱，尤其是免疫激活，笔者推测在抑郁症中很可能存在Treg的功能紊乱，其功能的恢复及免疫稳态的维持可能有利于抑郁症的治疗。

本研究中使用Hardy-Weinberg遗传平衡检验，发现Foxp3-6054、Foxp3-3279、Foxp3-924三位点基因具有群体代表性，证实抽样与分型结果可靠。以PCR-SSP法对所选择的全部样本进行Foxp3-6054、Foxp3-3279、Foxp3-924三位点基因多态性与中国广东地区 PPD相关性分析。通过分析发现Foxp3-6054单核苷酸基因多态性与中国广东地区PPD发病相关。携带Foxp3-6054 位点基因型AA基因型频率明显升高(P<0.05)，提示Foxp3-6054A/A位点可能是中国广东地区汉族人群 PPD发生的危险因子。而另外两个突变基因位点Foxp3-3279和Foxp3-924的研究发现其单核苷酸基因多态性与中国广东地区 PPD发病之间无显著相关(P>0.05)，因而推断Foxp3-3279和Foxp3-924位点可能不是 PPD发病的独立危险因素，与中国广东地区 PPD的发病未发现相关性。

基于基因型决定表型的理论，本文未对 PPD的严重程度进行分级，为科学验证Foxp3基因是否为广东地区 PPD的易感基因，建议增加样本量，扩大样本收集范围，检测该基因的多态性位点，进一步证实Foxp3基因型可能直接或间接改变细胞内Foxp3的表达水平导致或加重 PPD疾病的严重程度，检测CD4+CD25+Treg的表达数量，监测相关激素水平和激素受体基因多态性的变化，同时关注基因多态性与疾病临床表型多样性的内在联系。

[1]杨乐.抑郁症免疫失衡机制中多巴胺受体D3与调节性T细胞的关联作用[D].湖南：中南大学，2007.

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Explore the association between the polymorphism of Foxp3 gene and postpartum depression in Guangdong Province*

FENGGuilin1，PANKunyi2，DENGXiaoyan1△

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510260,China;2.SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou,Guangdong510235,China)

ObjectiveTo investigate the association of Fork shaped spiral gene transcription factor 3(Foxp3)-6054(deletion/ATT，rs5902434),Foxp3-3279(A/C,rs376158),Foxp3-924(A/G,rs2232365)with the morbidity of postpartum depression among the populations in Guangdong province.MethodsThe peripheral blood DNA samples were identified by means of polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR-SSP)analysis among 69 cases which were confirmed to be postpartum depression and 140 cases of healthy control of postpartum women,and then we analyzed the point mutation of Foxp3-6054,Foxp3-3279,Foxp3-924 as well as compare the differences between the two groups in gene polymorphisms.ResultsThe SNP gene frequency and genotype frequency of Foxp3-6054 was statistical significant among the group of postpartum depression and the control group(P<0.05),and the SNP gene frequency and genotype frequency of Foxp3-3279,Foxp3-924 was not statistical significant among the group of postpartum depression and the control group(P>0.05).ConclusionFrom the current investigation cases,the Foxp3-6054 could be proved to associated with the morbidity of postpartum depression among the populations in Guangdong province,and the Foxp3 gene Foxp3-3279,Foxp3-924 could not be proved to associated with the morbidity of postpartum depression among the population in Guangdong province.

forkhead helix transcription factor 3;single nucleotide polymorphism;postpartum depression

2016-01-10修回日期：2016-03-18)

广东省广州市属高校学科平台建设临床检验诊断学项目(穗教科2011-34)。

冯桂玲，女，主管技师，主要从事医学检验研究。△

， E-mail:dxyzgy@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.003

A

1673-4130(2016)12-1598-04