血清miR-21-5P和miR-155-5P表达对百草枯中毒患者诊断及预后的影响

兰超　郭楠楠　裴辉　史晓朋　张华丽　乔英杰

(郑州大学第一附属医院 急诊医学部　河南 郑州　450052)



血清miR-21-5P和miR-155-5P表达对百草枯中毒患者诊断及预后的影响

兰超郭楠楠裴辉史晓朋张华丽乔英杰

(郑州大学第一附属医院 急诊医学部河南 郑州450052)

【摘要】目的探讨血清miR-21-5P和miR-155-5P的表达对百草枯中毒患者诊断和预后的影响。方法选择2014年11月至2015年8月郑州大学第一附属医院收治的102例百草枯中毒患者，按入院时尿百草枯浓度分为轻型(32例)、中型(42例)、重型(28例)3组，并选取健康人30例作为对照组。记录各组患者临床资料，统计相关实验室检查指标，并通过RT-PCR检测受试者血清miR-21-5P和miR-155-5P的表达量，评估miR-21-5P和miR-155-5P在百草枯中毒临床诊疗中的价值。结果血清miR-21-5P和miR-155-5P诊断百草枯中毒的ROC曲线下面积分别是88.3%和83.9%；重型组的两种标志物表达量明显高于中型组、轻型组和健康组，差异有统计学意义(P<0.05)；死亡组miR-21-5P和miR-155-5P表达量均高于存活组，差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论百草枯中毒患者外周血 miR-21-5P和miR-155-5P表达水平增高，可能成为百草枯中毒诊断的标志物。两者对区分百草枯中毒严重程度及判断预后都具有积极的临床意义。

【关键词】百草枯中毒；miRNA；诊断；预后

百草枯为有机杂环类接触性除草剂，可经皮肤、呼吸道及消化道吸收造成急性中毒，是内科常见除草剂急性中毒之一。目前临床上尚缺乏特效治疗方法，有报道显示其病死率高达50%～80%[1]。百草枯可损害多个脏器功能，其中肺损伤是最突出和最严重的改变，可导致“百草枯肺”，早期表现为急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，后期则出现肺泡内和肺间质纤维化，是百草枯中毒患者致死的主要原因。

微小RNAs(MicroRNAs)又简称miRNAs，是一类长约19～25个核苷酸的小分子RNA，广泛存在于动物、植物、病毒和单个细胞等生物体中。miRNAs是一类重要的转录后调节基因，具有调节细胞增殖、分化、凋亡等过程的功能，并且可在血清中稳定表达[2]。近年来，miR-21-5P和miR-155-5P在免疫调节、肺损伤和肺纤维化等病理生理的发生、发展过程中的调控机制研究得到了广泛的关注[3]，然而对于miR-21-5P和miR-155-5P在百草枯中毒的诊断及预后判断方面尚缺乏临床病例研究。本研究采用实时荧光定量反应(RT-PCR)检测百草枯中毒患者血清中miR-21-5P和miR-155-5P的相对表达量，对照临床相关指标，探讨miR-21-5P和miR-155-5P对百草枯中毒诊断及预后的指导意义。

1资料和方法

1.1主要仪器和试剂miRNA提取分离试剂盒：TIANGEN DP501(北京天根生化科技有限公司)；miRNA cDNA第一链合成试剂盒：TIANGEN KR201(北京天根生化科技有限公司)；miRNA荧光定量检测试剂盒：TIANGEN FP401(北京天根生化科技有限公司)；ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；Bioplastics PCR八连管(上海百研生物科技有限公司)。

1.2研究对象选择2014年11月至2015年8月郑州大学第一附属医院收治的102例百草枯中毒患者进行研究。所有患者入院后均做尿液快速半定量检测，并按尿百草枯浓度检测结果分为3组：轻型(尿百草枯浓度<10 μg/ml)32例，中型(尿百草枯浓度10～30 μg/ml)42例，重型(尿百草枯浓度>30 μg/ml)28例。各组按转归分为死亡和存活两个亚组。选取30例健康体检者作为对照组。纳入标准：口服中毒，中毒距入院时间在4～24 h 内(多数患者来院不是首诊，故入院距服毒时间较长)，入院前未接受过血液灌流或血液净化治疗，既往无肺、肝、肾、心脏、肿瘤及血液系统等疾病，资料完整。诊断及分型标准：参照全国统编教材《急诊医学》《预防医学》“百草枯中毒”相关章节及国家标准《职业性急性百草枯中毒的诊断》和2013年第三届全国百草枯农药中毒学术会议对百草枯中毒诊断与治疗的“泰山共识”进行百草枯中毒诊断和分型。排除标准：合并其他毒物中毒者，妊娠及既往有肺、心脏、肝、肾、肿瘤及血液系统等疾病者。本项研究符合医学伦理学标准，所有研究对象均签署知情同意书，本项研究获得医院伦理委员会批准。

1.3治疗方法对服毒距入院时间<8 h的患者均给予清水洗胃，所有患者均给予活性碳或蒙脱石散吸附并给予导泻，置尿管导尿，在弃去膀胱内的残余尿后1 h留取尿标本待检。同时应用大剂量糖皮质激素(甲泼尼龙500～1 000 mg/d)、环磷酰胺、乌司他丁、血必净注射液及保护器官药物，口服心得安等药物以对抗百草枯毒性。当患者出现严重呼吸困难及动脉血氧分压(PaO2) <40 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)时给予低流量鼻导管吸氧。在取得患者和家属同意后给予床旁血液灌流(灌流均在留取血、尿标本之后进行)。

1.4检测指标及方法检测指标：记录患者的姓名、性别、年龄、中毒剂量、中毒距就诊时间、中毒距洗胃时间及28 d预后，同时记录患者入院时的尿百草枯浓度、白细胞计数(WBC)、尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(ALT)、D二聚体(D-D)、动脉血乳酸(Lac)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)和急性生理和慢性健康状态评分(acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ评分)等指标。健康对照组同期进行。

血清miR-21-5P和miR-155-5P的测定：于患者入院12 h内、血液灌流前抽取静脉血5 ml，在4 ℃下3 000 r/min离心10 min，提取血清；提取血清中总的miRNA；对miRNA 3’末端进行加Poly (A)处理，再进行逆转录反应生成miRNA对应的cDNA第一链；采用SYBR GreenI 染料法进行荧光定量检测miR-21-5P和miR-155-5P相对表达量(以上步骤均按照试剂说明书步骤进行，引物序列及内参照U6均由北京天根生化科技有限公司合成)。本实验采用ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪进行检测分析，以U6为内参照基因。采用2-△△Ct法计算miRNA的相对表达量(△△Ct=CtmiRNA-CtU6)。

1.5统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的两组定量资料比较采用t检验(方差不齐时采用校正t检验，多组均数比较采用单因素方差分析)，组间两两比较采用LSD-t检验，构成比的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。绘制miR-21-5P、miR-155-5P诊断百草枯中毒的ROC 曲线，并计算曲线下面积。

2结果

2.1一般资料共纳入102例百草枯中毒患者，其中男48例，女54例，年龄14～65岁，中毒剂量5～300 ml，中毒至就诊时间0.4～22 h，中毒距洗胃时间为0.4～8 h。中毒后28 d 内存活44例，死亡58例，病死率56.9%。按入院时尿百草枯浓度分为轻型、中型、重型3组。3组间性别、年龄、中毒距就诊时间差异均无统计学意义(P>0.05)；3组间中毒剂量、中毒距洗胃时间、WBC、BUN、ALT、PaCO2、Lac、APACHE Ⅱ评分差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　百草枯中毒患者入组时一般资料比较

2.2血清中miR-21-5P和miR-155-5P的表达对百草枯中毒的诊断效能miR-21-5P诊断百草枯中毒的曲线下面积是88.3%(95%CI：0.813～0.953)，当miR-21-5P表达量为0.56时约登指数为最大值。miR-155-5P诊断百草枯中毒的曲线下面积是83.9%(95%CI：0.759～0.919)，当miR-155-5P表达量为0.67时约登指数为最大值。见图1。

图1　miR-21和miR-155诊断百草枯中毒的ROC曲线

2.3不同严重程度百草枯中毒患者血清中miR-21-5P和miR-155-5P表达量对比重型组的miR-21-5P和miR-155-5P表达量明显高于中型组、轻型组和健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　不同严重程度百草枯中毒患者血清miR-21-5P和

2.4百草枯中毒患者预后相关因素分析将102例百草枯中毒患者按中毒后28 d预后分为存活组和死亡组，两组间性别、年龄、中毒距就诊时间差异均无统计学意义(P>0.05)；死亡组中毒剂量、中毒距洗胃时间、尿百草枯浓度、WBC、BUN、ALT、Lac、APACHE Ⅱ评分、miR-21-5P和miR-155-5P表达量明显高于存活组，差异有统计学意义(P<0.05)，PaCO2明显低于存活组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3　存活组和死亡组各项临床指标比较

3讨论

百草枯中毒多以消化道吸收中毒常见，患者多为自服或误服中毒。百草枯口服后吸收迅速，0.5～4 h达血浆浓度峰值，吸收后迅速分布到肺、肾、肝等器官，并在肺内聚集[4]。急性百草枯中毒机制较复杂，除了百草枯本身理化作用外，还有大量的炎性因子和细胞因子参与机体的氧化损伤、炎症反应、凝血系统异常、细胞凋亡等过程[5]。临床上可出现多脏器功能受损，其中以肺损伤为主，危害最大。近年来百草枯中毒的发病率愈来愈高，国内外一直致力于百草枯中毒的研究，但至今尚无有效解毒药，许多治疗方法仍处于探索中，缺乏循证医学的证据。

miRNAs是一类非常重要的机体调控因子，在调节生长、维持生物体自身稳态、参与疾病病理生理过程等方面都发挥重要作用，是近年来的研究热点。已有诸多研究表明，miRNAs与肺损伤、肺内纤维化的发生发展密切相关。有研究发现，内毒素可引起巨噬细胞中miR-132、miR-146a、miR-155表达水平增加。还有研究发现，特发性肺纤维化进展速度快慢可能是miR-302c、miR-423-5p、miR-210等调节的结果。另有研究表明，let-7对肺纤维化的发生发展起着负调控作用，提出let-7d不仅可能是肺纤维化一个潜在的治疗靶点，还可能是监测疾病进展的一个标志物。

miR-21-5P编码基因定位于TMEM49基因编码区内，通过自身启动区完成转录及poly A尾聚合，最终变为成熟的miRNA。miR-21与多种疾病相关[5]。有的研究发现，miR-21在博莱霉素诱导的纤维化小鼠和特发性肺纤维化患者肺内的表达都增高，提示miR-21对肺纤维化发生起着正向推动作用。此外，还有研究证明，miR-21参与调节机体免疫过程，对不同信号传导的靶蛋白起关键调控作用。本项研究显示miR-21-5P表达量上调，可做为百草枯中毒诊断的标志物，具体作用机制尚不明确，可能与百草枯中毒患者大多存在肺损伤和肺纤维化有关。

miR-155-5P是一个多功能miRNA，位于人类21号染色体B细胞非编码集合基因簇的第3个外显子中，在免疫应答的调控中发挥重要作用[7]。有研究表明miR-155能够影响Th1、Th2细胞的功能，对活化T细胞具有一定调节作用[8]。汪勤等[9]的研究表明miR-155参与对Treg细胞增殖的调节，在脓毒症免疫失衡机制中发挥一定的作用。本研究结果显示，健康组与轻中重型组间、生存组与死亡组间miR-155-5P表达量差异有统计学意义(P<0.05)。由此推断，miR-155-5P可作为百草枯中毒诊断的标志物，亦可对百草枯中毒诊断、病情严重程度、预后做出预警。

综上所述，本实验探讨了miR-21-5P和miR-155-5P与百草枯中毒诊断及预后判断的关系，结果发现健康组与轻中重型组间、生存组与死亡组间miR-21-5P和miR-155-5P表达量差异有统计学意义(P<0.05)，miR-21-5P、miR-155-5P在死亡组的相对表达量显著增高。miR-21-5P和miR-155-5P可作为百草枯中毒诊断和预后判断的新标志物，作为基因层面的生物标记物，有可能为百草枯中毒的治疗开辟新的天地。本项研究的样本量较小，且未进行远期预后的随访，不能明确miR-21-5P和miR-155-5P对百草枯中毒远期预后的影响。总之，这两个标志物对百草枯中毒的临床意义还需更加深入的研究。

参考文献

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[9]汪勤,赵春辉,蔡琴,等.脓毒症患者外周血微小RNA-155和调节性T细胞表达的关系[J].中华危重病急救医学,2014,26(3):179-183.

The guiding significance of miR-21-5P and miR-155-5P expressed in serum for the diagnosis and prognosis of paraquat intoxication

Lan Chao, Guo Nannan, Pei Hui, Shi Xiaopeng, Zhang Huali, Qiao Yingjie

(DepartmentofEmergency,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the guiding significance of miR-21-5P and miR-155-5P expressed in serum for the diagnosis and prognosis of paraquat intoxication. Methods102 cases of patients with paraquat intoxication in the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University from November of 2014 to August of 2015 were chosen and divided into the mild group(n=32), moderate group(n=42), and severe group(n=28) according to their semi-quantification results of urine paraqua when they were admitted to the hospital. At the same time, 30 healthy persons were selected as the control group. The clinical data and related indicators of each group were collected, and the expression of miR-21-5P and miR-155-5P was measured to evaluate their clinical value in the diagnosis and treatment of paraquat intoxication. ResultsThe area under the ROC curve was 0.883 for the diagnosis of paraquat intoxication using miR-21-5P, while that was 0.839 using miR-155-5P. The expression of miR-21-5P and miR-155-5P was statistically different between the healthy, mild, moderate, and severe groups. There was also statistically significant difference between survival and death group (P<0.05). ConclusionThe expression of miR-21-5P and miR-155-5P in serum may be used as an indicator for the diagnosis of paraquat intoxication, and they have positive clinical significance for the prognosis of paraquat intoxication.

【Key words】paraquat intoxication; miRNA; diagnosis; prognosis

基金项目：国家临床重点专科项目(2012649)；河南省基础与前沿

通讯作者：兰超，E-mail：lanchao29@163.com。

【中图分类号】R 605.97

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.06.003

(收稿日期：2016-03-11)

技术研究计划项目(142300410068)。