碱性成纤维细胞生长因子联合血管内皮细胞生长因子促进自体脂肪移植成活的动物实验研究

仇利红, 韩 悦, 郑 惠, 易成刚, 伍锦华



实验研究

碱性成纤维细胞生长因子联合血管内皮细胞生长因子促进自体脂肪移植成活的动物实验研究

仇利红, 韩 悦, 郑 惠, 易成刚, 伍锦华

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合血管内皮细胞生长因子(VEGF)对大鼠自体脂肪移植血管新生及成活的影响。方法 建立大鼠自体脂肪移植模型，将腹股沟处脂肪组织与生长因子蛋白溶液或生理盐水混合移植于大鼠背部。大鼠背部随机注射脂肪组织与生理盐水或0.5 μg bFGF、1.0 μg bFGF、2.0 μg bFGF、0.5 μg bFGF+0.5 μg VEGF、1.0 μg bFGF+1.0 μg VEGF。12周后，对移植物进行成活率分析、组织学观察以及CD31免疫组织化学染色。结果 向0.3 ml脂肪组织中添加2.0 μg bFGF可显著提高移植物成活率及微血管密度。0.5 μg bFGF组及1.0 μg bFGF组与生理盐水组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；但分别联合应用0.5μgVEGF和1.0μgVEGF以后，可显著升高移植物成活率，差异具有统计学意义(P<0.05)。1.0μgbFGF+1.0μgVEGF联合应用组的移植物成活率和血管密度亦高于2.0μgbFGF单添加组。结论 相比单独应用bFGF，VEGF与bFGF联合应用可刺激更多的血管生成，从而提高移植脂肪的成活率。

碱性成纤维细胞生长因子； 血管内皮细胞生长因子； 血管生成； 脂肪移植

自体脂肪由于具备来源丰富、操作简单、无排斥反应以及塑形效果自然等优点，常被作为理想的软组织填充材料应用于整形和重建手术。但是脂肪组织的术后低成活率使得手术长期效果难以预测，限制了其在临床的广泛应用。因此，如何提高移植脂肪组织的成活率是目前众多学者关注的焦点。自2015年11月至2016年3月，笔者采用不同浓度的外源性细胞因子与大鼠自体颗粒脂肪混合注射移植的方法，研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促进血管生成的情况以及提高脂肪移植成活率的潜能，探索bFGF和VEGF促进血管新生的协同作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

健康雌性SD大鼠11只，体质量200～250 g，由解放军第四军医大学动物实验中心提供。重组大鼠VEGF165蛋白、重组大鼠bFGF蛋白(美国PEPROTECH公司)，Anti-CD31小鼠单克隆抗体(英国ABCAM公司)，小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 实验分组及手术步骤

1.2.1 实验分组 实验分为生理盐水对照组(A组)，0.5 μg bFGF组(B组)，1.0 μg bFGF组(C组)，2.0 μg bFGF组(D组)，0.5 μg bFGF+0.5 μg VEGF组(E组)，1.0 μg bFGF+1.0 μg VEGF(F组)。将11只大鼠背部不同注射部位按简单随机抽样分配的方法分为以上6组，每组注射7次。

1.2.2 大鼠自体脂肪移植 腹腔内注射2%戊巴比妥钠，待大鼠麻醉成功后，于双侧腹股沟和背部备皮，常规消毒铺巾。从大鼠腹股沟处切取约1.5 ml的脂肪组织，生理盐水冲洗，剪碎至颗粒。按上述分组称取所需的生长因子蛋白粉末，稀释于0.2 ml生理盐水中。将脂肪组织与生长因子溶液或生理盐水混合，随机注射入大鼠背部皮下不同位置。

1.3 检测指标

1.3.1 计算脂肪移植成活率 分别于术后12周麻醉处死大鼠，剥离脂肪移植物，用排水法测量体积，计算成活率。

1.3.2 病理学染色 将所取标本迅速置于10%甲醛中固定。24～48 h常规脱水、浸蜡、包埋、切片，行苏木素-伊红染色。光镜下观察并拍照，进行组织学评价。

为进一步检测脂肪组织新生血管密度，行CD31免疫组织化学染色：石蜡切片，65℃烘烤，脱蜡、水化后微波修复抗原，3%H2O2去内源性过氧化物酶，一抗为鼠源Anti-CD31抗体(1∶250稀释)，于4℃孵育过夜；第2天按照小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂盒进行DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。PBS代替一抗作为空白对照。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 脂肪移植成活率比较

于术后12周，采用移植物体积保持率(volume retention rate)代表移植脂肪成活率。结果显示，与生理盐水组(27.14±1.49)%相比，2.0 μg bFGF组脂肪移植成活率(52.21±3.93)%较高，差异具有统计学意义(P<0.05)，而0.5μgbFGF组(30.36±3.59)%及1.0μgbFGF组(38.57±5.74)%相比，差异无统计学意义(P>0.05)。而当联合应用0.5μgbFGF+0.5μgVEGF或1.0μgbFGF+1.0μgVEGF时，脂肪成活率显著提高，分别为(53.43±5.29)%，(69.86±2.87)%，且联合应用组的移植物成活率均高于相应剂量的bFGF单添加组，而1.0μgbFGF+1.0μgVEGF组的移植物成活率甚至高于2.0μgbFGF单添加组。

2.2 移植物组织学观察

进一步用HE染色观察脂肪移植物炎性细胞浸润、纤维化程度以及脂肪细胞完整性等。如图1所示，A组和B组脂肪组织被大量炎性细胞浸润，脂肪细胞被纤维组织包裹或分隔，脂肪细胞所占面积小。随着细胞因子浓度的增高和两种细胞因子的联合应用，炎性细胞和纤维组织均见减少，纤维间隔变薄，脂肪细胞结构完整，细胞间质可见新生的血管(图1f红色箭头所示)。

2.3 血管密度比较

采用CD31免疫组化的方法观察脂肪组织中的新生血管情况。如图2a所示，在脂肪细胞周围的间质中，内皮细胞被标记为深棕色，并连接成血管样结构。应用Image-ProPlus6.0计数微血管密度(microvesseldensity,MVD)，对于组织中常存在的较大的管腔，不列入微血管进行计数，见图2b。统计结果显示(图2c)，相比生理盐水组(3.40±0.29)，单独应用2.0μgbFGF可显著增加移植物中的血管密度(6.30±0.38)。相比相应剂量的bFGF单添加组(B组和C组，分别为3.13±0.36和3.80±0.45)，联合应用组(E组和F组，分别为5.53±0.53和8.73±0.81)血管密度增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。与脂肪移植成活率相一致，1.0μgbFGF+1.0μgVEGF联合应用组的血管密度高于2.0μgbFGF单添加组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

为了改善移植的脂肪组织缺血损伤，许多学者尝试将各类血管生长因子应用于促进脂肪移植的成活。1992年，Eppley等报道，混有bFGF(以葡聚糖珠为载体)脂肪组织移植物的成活率远高于单纯脂肪移植组。1998年，廖天安等证明，bFGF(以纤维蛋白为缓释剂)的促移植脂肪成活作用具有浓度依赖性，以在0.2 g移植脂肪中加入4000 U bFGF效果最佳。2005年，杜学亮等通过对微血管定性和定量分析，证明bFGF(以多聚糖酐珠为载体)可以促进移植体血管化，进而促进移植脂肪的成活。为了使血管生长因子更持久、更稳定地发挥促血管再生作用，近些年的相关研究多集中在微球缓释技术的探索上，但由于生物相容性和安全性等问题，以及相关制备过程和应用标准尚缺乏统一标准，该技术的临床应用仍受到限制。目前，局部生长因子蛋白(混合)注入仍是临床研究应用最多的方法。易阳艳[1]和李卫华等[2]的临床对照研究发现，将bFGF直接加入移植物中，可促进移植脂肪的成活，提升自体脂肪移植对面部凹陷的治疗效果；近年黄成等[3]报道，纯化脂肪颗粒与成纤维细胞生长因子混合可提高自体脂肪移植隆乳术术后乳房隆起值及满意度。

图1 脂肪移植物组织学观察(×100) a～f. 分别代表实验A～F组 图2 各组微血管密度 a. 标记的微血管(×200) b. 较大的血管腔不参与微血管计数(×200) c.各组微血管密度统计结果 (与A组相比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与B组相比较，#P<0.05；与C组相比较，&P<0.01；与D组相比较，$P<0.05；与E组相比较，aP<0.01)

Fig 1 Histologic observation of the transplanted fat tissues (×100). a～f. respectively represent group A～F. Fig 2 MVD in each group. a. marked microvessels counted (×200). b. large vessel lumens were not defined as a microvessel (×200). c. statistical results: of MVD in each group (*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,comparedwithgroupA;#P<0.05comparedwithgroupB;

&P<0.01comparedwithgroupC;$P<0.05comparedwithgroupD;aP<0.01comparedwithgroupE.).

由于各实验脂肪移植的体积、实验目的等不同，bFGF的应用剂量波动较大。本实验采用直接混合注射的方法，将不同浓度的bFGF与脂肪颗粒混合注入大鼠皮下，以检测bFGF的促脂肪移植物成活效应。结果显示，2.0μgbFGF可显著提高移植脂肪的成活率和血管密度，与廖天安和杜学亮等报道一致。在本实验中，添加0.5μgbFGF和1.0μgbFGF均不能降低脂肪的吸收，这可能是因为bFGF用量过低，低于其有效作用剂量，不能发挥其生物学效应；此外，也可能与单个生长因子治疗效果有限有关。

VEGF是目前所知的最为有效的血管形成促进因子，特异性最高。有研究认为,在脂肪移植的受区提供VEGF，可因周围血管的增多而提高脂肪移植的成活率。血管形成是一个动态的过程，涉及多种细胞及细胞因子的相互作用，多种因子联合应用可能会产生更好的促进效果。1995年，TAsahara等研究结果显示，相比单用其中任意一种生长因子，VEGF和bFGF联合应用可显著增加血管新生，改善兔子缺血后肢的血运。另有一些体内外实验研究亦证明,两种生长因子联合应用比单因子有更强大的促血管新生作用[4]。很多学者认为生长因子半衰期短，单纯注入的VEGF蛋白，因作用时间短而无法持续发挥生物效应[5]。我们的研究结果表明，VEGF可协同bFGF刺激移植脂肪的血管形成，减轻组织坏死，提高脂肪移植的成活率。

VEGF、bFGF都是血管内皮细胞的丝裂原，能增强血管内皮细胞分裂增殖，抑制血管内皮细胞调亡，促进早期原始血管网的形成；VEGF、bFGF还可促进脂肪干细胞的增殖和分化[6]。近期研究报道，将这两种因子辅助脂肪干细胞或SVF应用于脂肪移植，可进一步增加移植物成活率和成活质量[7-8]。VEGF虽显示，可强有力地促血管生长，但存在注射部位血管通透性强、易渗漏的问题。而bFGF是一种作用广泛的生物活性物质，可作用于不同血管成分细胞，如成纤维细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞，影响内皮细胞迁移增生、胶原合成、毛细血管基膜降解等多个血管形成环节。研究发现，bFGF与VEGF激活不同的信号通路[9]，形成不同的血管表型[10]。以上可以看出，bFGF与VEGF起着不同而互补的促血管作用，两者联合应用，可更好地的促进有功能的血管生成及有效血运的建立，进而发挥促脂肪成活的效应。

出于对安全性的考虑，生长因子单纯的局部应用目前只批准了外用剂型，主要用于促进溃疡、褥疮、烧伤等创面愈合，而体内应用的生长因子仍未获批准。生长因子辅助自体脂肪移植带来的主要危害，为受区组织不可控的增生。而在本实验中，未观察到移植组织或者受区出现严重的增生情况，说明本实验所应用的生长因子剂量，可能在安全范围之内，也可能与个体差异等因素有关。那么，生长因子应用的安全浓度究竟如何，生长因子的浓度升高是否会导致该现象的发生? 我们将在接下来的实验中进一步总结。

[1] 易阳艳, 胡琼华, 林 涛, 等. 碱性成纤维细胞生长因子在人体脂肪移植中的应用[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2007,11(29):5665-5667.

[2] 李卫华, 孙志成, 王 文, 等. 碱性成纤维细胞生长因子对人前脂肪细胞增殖和分化的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2009,13(45):8817-8820.

[3] 黄 成, 王海东, 田立粮, 等. 成纤维细胞生长因子对自体脂肪移植隆胸术的效果影响[J]. 中国医疗美容, 2015,5(2):41-42.

[4]WangL,YingYF,OuyangYL,etal.VEGFandbFGFincreasesurvivalofxenograftedhumanovariantissueinanexperimentalrabbitmodel[J].JAssistReprodGenet, 2013,30(10):1301-1311.

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[6] 王 钰, 朱志图, 陈峻江. 血管内皮生长因子165基因促进人脂肪间充质干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2015,(28):4485-4492.

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[8]JiangA,LiM,DuanW,etal.Improvementofthesurvivalofhumanautologousfattransplantationbyadipose-derivedstem-cells-assistedlipotransfercombinedwithbFGF[J].ScientificWorldJournal, 2015:968057.

[9]Kiec-WilkB,Grzybowska-GaluszkaJ,PolusA,etal.TheMAPK-dependentregulationoftheJagged/NotchgeneexpressionbyVEGF,bFGForPPARgammamediatedangiogenesisinHUVEC[J].JPhysiolPharmacol, 2010,61(2):217-225.

[10]FalconBL,SwearingenM,GoughWH,etal.Aninvitrocordformationassayidentifiesuniquevascularphenotypesassociatedwithangiogenicgrowthfactors[J].PLoSOne, 2014,9(9):e106901.

Synergistic effect of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor on the improvement of the survival of autologous fat transplantation in vivo

QIULi-hong,HANYue,ZHENGHui,YICheng-gang,WUJin-hua.

(DepartmentofPlasticSurgery,XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

WUJin-hua,Email:jinxiunianhua@163.com

Objective To investigate the synergistic effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in angiogenesis and survival of transplanted fat in a rat autologous fat transplantation model. Methods Autologous fat tissue from inguinal regions was mixed with growth factor protein solutions or saline and transplanted into the back of rats. Rats were randomized to transplant fat with either normal saline or 0.5 μg bFGF, 1.0 μg bFGF, 2.0 μg bFGF, 0.5 μg bFGF+0.5 μg VEGF, 1.0 μg bFGF+1.0 μg VEGF. Twelve weeks later, the grafts were assessed by survival rate analysis, histological observation, and immunohistochemical staining for CD31. Results Adding 2.0 μg bFGF in 0.3 ml fat tissue may significantly improve microvessel density and graft survival. There was no significant difference in the 0.5 μg bFGF group and the 1.0 μg bFGF group compared with the saline group (P>0.05),butwhenitwascombinedwith0.5μgVEGFor1.0μgVEGF,respectively,thedifferencewassignificant(P<0.05).Thegraftsurvivalandthemicrovesseldensityinthe1.0μgbFGF+1.0μgVEGFgroupwasalsohigherthanthatinthe2.0μgbFGFgroup. Conclusion Compared with bFGF alone, the combined administration of VEGF and bFGF can significantly stimulate angiogenesis, resulting in increased survival of transplanted fat tissue.

Basic fibroblast growth factor; Vascular endothelial growth factor; Angiogenesis; Fat transplantation

710032 陕西 西安，第四军医大学西京医院 整形外科(仇利红,韩 悦,郑 惠,易成刚)；西安市中心医院 整形 外科(伍锦华) 第一作者：仇利红(1987-)，女，山东临沂人，硕士研究生. 通信作者：伍锦华，710032，西安市中心医院 整形外科，电子信箱：jinxiunianhua@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.12.017

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A

1673-7040(2016)12-0759-04

2016-06-23)