SD大鼠自然衰老皮肤组织模型的检测

董晓宏, 马晓冬, 余 晶, 吴毅平



实验研究

SD大鼠自然衰老皮肤组织模型的检测

董晓宏, 马晓冬, 余 晶, 吴毅平

目的 通过比较4周龄年轻大鼠与18个月龄年老大鼠背部皮肤相关指标的差异性，确定自然衰老大鼠皮肤模型的建立。方法 取年轻组和年老组大鼠背部皮肤组织，分别进行组织学HE染色、Masson 染色和EVG染色，观察皮肤组织学形态变化；计算皮肤组织中真皮层厚度、胶原纤维和弹力纤维的相对面积值，并进行两组间比较。测定皮肤组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化脂质代谢产物丙二醛(MDA)和皮肤羟脯氨酸(Hyp)的含量。结果 组织切片染色显示，SD大鼠年老组较年轻组皮肤层厚度变薄，胶原纤维面积和弹力纤维面积均减少(n=5,P<0.05)。年老组皮肤组织中SOD和Hyp含量低于年轻组，而MDA含量则年老组高于年轻组(n=5,P<0.05)。结论 4周龄年轻组大鼠皮肤与18个月龄年老组大鼠皮肤存在较大差异，且年老组大鼠皮肤抗氧化能力下降，胶原纤维含量减少，染色变浅，弹力纤维减少、变形，有部分呈断裂、缠结，可以作为自然衰老皮肤的实验动物模型。

自然衰老; 衰老皮肤; 超氧化物歧化酶; 过氧化脂质代谢产物丙二醛; 皮肤羟脯氨酸

皮肤衰老是一种长期变化的过程，相关研究者提出了较有影响和代表性的学说，主要有内源性的皮肤衰老包括：遗传基因调控学说、组织代谢失调学说、氧自由基学说；外源性的皮肤衰老，包括：有光老化、生存环境、生活方式等学说[1-3]。研究和解决衰老等问题，需建立衰老的实验动物模型，通过衰老的动物模型来研究评价衰老的指标、衰老的机制和抑制衰老的方法。对皮肤衰老的检测，目前还没有一种较为规范的评价体系，结合相关研究报道并总结衰老后的组织学检测结果显示，真皮内的胶原蛋白、弹力纤维和相应的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、羟脯氨酸(Hydroxyproline, Hyp)和过氧化脂质代谢产物丙二醛(malondialdehyde, MDA)等成分在皮肤衰老过程中，都有较明显的变化[4]。自2015年9月，包头市第四医院整形外科设计用自然衰老实验动物进行模拟人衰老皮肤模型，通过组织切片进行形态学检测，用特异性化学方法检测皮肤组织中相关生化指标的改变 。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体(specefic pathogen free, SPF)雌性SD大鼠，4周龄(70～80 g)、18个月龄(400～510 g)，购于湖北省实验动物研究中心。所有实验动物均饲养与华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物中心动物房。取材部位：SD大鼠脊柱两侧背部皮肤组织。

1.2 方法

1.2.1 动物检测 按4周龄和18个月龄分为两组：年轻组与年老组，每组5只SD大鼠，所有SD大鼠均为雌性。

1.2.2 皮肤组织取材 切取大鼠背部皮肤，一部分放入4%多聚甲醛中浸泡固定；另一部分皮肤组织块称取重量并进行标号、记录，迅速放入无菌冻存管内，保存在液氮中，以备后续实验需要。

1.2.3 衰老皮肤的形态学变化观察 将浸泡在4%多聚甲醛中的皮肤组织标本，进行石蜡包埋，切成4 μm厚度的石蜡切片，分别进行HE染色、Masson染色、EVG染色。检测SOD、MDA、Hyp的含量，均采用南京建成生物工程研究所试剂盒。

1.2.4 半定量检测 由IPP专业图像分析软件在相同条件下，进行皮肤厚度、胶原纤维和弹力纤维相对面积半定量检测。

2 结果

2.1 两组皮肤组织形态学检测比较

HE染色显示：年轻组的皮肤组织结构完整，各组织间结构清晰，细胞有序排列；年老组的真皮层厚度减小，有部分角化层分布，组织层次较疏松，细胞杂乱排列。Masson 染色显示：年轻组胶原纤维整齐排列、均匀分布，纤维染色清楚；年老组的胶原纤维杂乱，粗细不均等，纤维染色界限不清。EVG染色显示：年轻组弹性纤维染色清晰，形态规则，界限清楚；年老组的弹性纤维较少，分布不规则，形态不等。两组比较差异有统计学意义(n=5,P<0.05)。见表1，图1～3。

2.2 两组大鼠皮肤生化指标数据比较

年老组的SOD和Hyp含量均明显低于年轻组的数值，而年老组的MDA的含量却高于年轻组的表达，两组间差异有统计学意义(n=5,P<0.05)。见表2。

表1 两组皮肤形态学指标比较

表2 两组皮肤生化指标比较

3 讨论

人类皮肤在自然衰老的过程中，受内源性和外源性多种因素的影响，所获得的衰老皮肤模型很难排除其他非相关性的干扰因素，同时还存在医学伦理学等对实验规范的要求。故本课题实验模型选择18个月龄雌性SD大鼠，检测SD大鼠皮肤自然衰老过程中皮肤组织形态的变化和相关生化指标的变化情况[5]，由此来确定皮肤衰老模型的建立。

皮肤的衰老从组织形态学上观察，可体现在衰老皮肤的表皮钉变浅和减少，表皮与真皮层交界处链接较平坦，衰老皮肤组织内细胞间连接较疏松，角质层增厚，以及含水量减低(RO Potts, 1984年；W Montagna, 1979年)。在衰老皮肤内，胶原纤维和弹力纤维网状层排列的结构发生改变，形态也变得不规则。由于胶原纤维和弹力纤维的退化导致了皮肤的松弛，从而增加了皮肤皱褶(IM Braverman, 1982年)。

图1 真皮厚度(HE ×40) a. 年轻组 b. 年老组 图2 胶原纤维含量(Masson ×200) a. 年轻组 b. 年老组 图3 弹力纤维含量(EVG ×400) a. 年轻组 b. 年老组

Fig 1 Dermal thickness (HE ×40). a. young group. b. aged group. Fig 2 Collagen fiber content (Masson ×200). a. young group. b. aged group. Fig 3 Elastic fibers content (EVG ×400). a. young group. b. aged group.

皮肤组织内胶原蛋白中Hyp约占13.4%，而在弹性纤维中确较少。组织内其他蛋白中不存在Hyp，而胶原蛋白主要分布在皮肤、软骨、肌肉和血管等处；Hyp的含量随身体的发育而增长，可以从尿液中排出体外，待机体停止发育后，Hyp的含量趋于稳定，故年老比年轻皮肤中Hyp的含量减少。因而，检测Hyp的含量，可以间接地反应因胶原纤维代谢所引发的结缔组织疾病。所以，测定皮肤组织中Hyp的含量，可以评价皮肤衰老治疗前后的变化情况。本实验结果显示，4周龄与18个月龄雌性SD大鼠的皮肤组织相关检测有明显的差异性，证明18个月龄SD大鼠可作为动物实验的衰老模型。

对比两组不同鼠龄的皮肤组织检测指标，由结果可知，其皮肤组织学切片在形态学表现有非常特异性的不同；SOD、Hyp和MDA3种酶学指标含量，在年轻组与年老组检测显示其含量有较大差别；检查结果通过统计学的分析显示，有明显的差异性，且有统计学意义(P<0.05)。因此，总结相关实验限定条件可以得出，18个月龄雌性SD大鼠自然衰老的皮肤模型可以成立。

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Detection of the natural aging skin tissue model in SD rats

DONGXiao-hong,MAXiao-dong,YUJing,WUYi-ping.

(DepartmentofPlasticSurgery,TheFourthHospitalofBaotou,Baotou014030,China)

WUYi-ping,Email:us_ypw@hotmail.com

Objective By comparing the difference of the relevant index in dorsal skin between the young rats (four weeks) and aged rats (eighteen months), the natural aging rat skin model was established. Metho-ds The dorsal skin of four-week-old young rats and eighteen-month-old aged rats was cut, for histological HE staining, Masson staining, and EVG staining to observe morphological changes. The thickness of the subcutaneous dermis, composition of collagenous fiber and elastic fibers in the skin were compared between the two groups of rats. The activity of superoxide dismutase (SOD), content of lipid peroxidation product malondialdehyde (MDA) and hydroxyproline (Hyp) in the skin tissue of the two groups were tested and compared. Results Histological staining shows that the skin is thinner and the elasticity fibrin is less in the aged group than that in the young group. The difference is statistically significant (P<0.05,n=5).ThecontentoftheSODandhydroxyprolineinskinishigherintheyounggroupthanthatintheagedgroup,andthecontentofMDAishigherintheagedgroupthanthatintheyounggroup.Thedifferenceisstatisticallysignificant(P<0.05,n=5). Conclusion There are great differences between the skin of rats at eighteen months and four weeks. In the aged group, the antioxidant ability decreased, the content of collagen fiber was lower, indicated by lighter staining. The elasticity of fibers was decreased and deformed with some breaking and entanglement, indicating that rats can be used as an experimental animal model for natural aging skin.

Natural aging； Aging skin； Superoxide dismutase; Malondialdehyde; Hydroxyproline

014030 内蒙古 包头，包头市第四医院 整形外科(董晓宏,马晓冬);华中科技大学附属同济医院 整形美容外科(余 晶, 吴毅平) 第一作者：董晓宏(1976-)，男，内蒙古包头人，副主任医师，硕士研究生. 通信作者：吴毅平，430030，华中科技大学附属同济医院 整形美容外科，电子信箱：us_ypw@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.12.015

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A

1673-7040(2016)12-0752-04

2016-06-06)