PCR-CTPP在DNA碱基切除修复基因SNP分型中的应用

彭　杨，程　燚，杨宇馨，李崇义，李梦侠，张诗珩，王　东

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心，重庆 400042)



PCR-CTPP在DNA碱基切除修复基因SNP分型中的应用

彭杨，程燚，杨宇馨，李崇义，李梦侠，张诗珩，王东△

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心，重庆 400042)

[摘要]目的分析两对引物-聚合酶链式反应(PCR-CTPP)在碱基切除修复(BER)途径基因单核苷酸多态性(SNP)分型中的应用，为发现新的SNP检测方法提供实验依据。方法采用PCR-CTPP扩增BER途径关键蛋白OGG1、XRCC1及APE1 4个常见SNP位点OGG1 Ser326Cys、XRCC1 Arg399Gln、APE1 Asp148Glu及-141T/G(位于启动子区域)的DNA片段，凝胶电泳显像后判读基因型，同时与DNA测序的方式比对各基因位点的准确性。结果PCR-CTPP方法基因分型结果与DNA测序得到的基因分型结果完全一致。结论PCR-CTPP技术可靠、快速，其广泛应用能够有助于基因SNP的分型研究。

[关键词]多态性，单核苷酸；两对引物-聚合酶链式反应；碱基切除修复途径

DNA损伤可被体内外一系列理化因素诱发，是影响细胞生理功能甚至存活的重要过程。精确的DNA修复过程对于维持细胞正常状态及染色体稳定性十分重要[1]。碱基切除修复(base excision repair，BER)通路是修复DNA损伤的重要途径，其目的是移除和代替受损的核苷酸。这个过程通常由某种底物特异性的DNA糖基化酶启动，糖基化酶可以识别和切除一些经过特定修饰的碱基，所产生的脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点，则是被AP内切酶，即脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/aprimidinic endonuclease,APE1，也称为APEX1或Ref-1)剪切。随后产生的AP位点由DNA连接酶修补[2]。参与BER途径的关键蛋白主要有3种，8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(8-Oxoguanine glycosylase，OGG1)，APE1和X线修复交叉互补基因 1(X-ray cross complementing group 1，XRCC1)。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是一种常见的基因变异，研究发现基因的SNP可能通过改变蛋白的结构或活性从而参与众多生物学过程。通过高通量测序、芯片等方式确定功能性SNP的基因型和氨基酸，对于明确其生物学功能，研究其与临床问题间的相关性具有重要意义[3-4]。DNA修复途径的SNPs被证实可能引起多种肿瘤发病风险的改变[5-7]。在BER途径的3种关键蛋白中，研究最多的SNP位点包括OGG1 Ser326Cys、APE1 Asp148Glu及XRCC1 Arg399Gln，这些变异位点都位于编码区，可能导致蛋白序列的改变，而非编码区，特别是启动子区域的基因变异可能会导致基因表达的变化，从而产生后续的生物学效应。因此，确定这些蛋白的基因分型可能具有重要意义。

常用的检测SNP基因分型的方法包括高通量的SNP芯片和采用Taqman探针的PT-PCR，以及低通量的限制片段长度基因分型-PCR(PCR-restriction fragment length polymorphism genotyping,PCR-RFLP)。但目前而言，由于普通实验室及临床应用上难以在短时间内获取大量样本，因此高通量检测的实用性在普通临床检验上受到极大限制；PCR-RFLP是一种常用的廉价检测方式，其原理基于内切酶剪切，关键技术在于选择合适的内切酶及引物，若是存在错配序列的话还需设计专门的错配引物，因此极大的增加了研究难度，导致整体实验时间延长[8]。因此，新的SNP基因分型方法亟待推广。两对引物-聚合酶链式反应(PCR-confronting two-pair primers,PCR-CTPP)是一种新型的SNP基因分型方法，已有研究报道其已经成功完成了超过30种不同的SNP分型[9]。本试验以PCR-CTPP方法检测在BER途径3种蛋白的4个SNP位点(OGG1 Ser326Cys、APE1 Asp148Glu、-141T/G及XRCC1 Arg399Gln)，并与DNA测序结果进行比较，进一步探讨该方法在基因SNP检测与分析中的应用价值。

1资料与方法

1.1一般资料本研究收集了第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心2014年1～6月住院非小细胞肺癌患者的血液样本。所有患者均已经病理学或细胞学确诊。采用EZNASE血DNA试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,United States)提取每位患者的基因组DNA，并分装冻存于-80 ℃。

表1　4种SNPs的引物序列及扩增片段长度

所提取的标本用于检测以下DNA位点：OGG1(rs1052133;Ser326Cys,C/G位于7号外显子)，APE1(rs1130409;Asp148Glu,T/G位于5号外显子及rs1760944;-141T/G位于启动子区)，以及XRCC1(rs25487;Arg399Gln,G/A位于10号外显子)。试验流程及标本采集过程经大坪医院伦理委员会讨论通过，并已获得每位患者的知情同意书。

1.2方法

1.2.1引物序列根据GenBank，结合合适的退火温度等条件设计引物序列，见表1。

1.2.2PCR-CTPP检测与基因型判读PCR扩增体系为25 μL，包括2 μL基因组DNA，12.5 μL Go Taq MIX(2x)及6.5 μL dH2O，每个体系里都包含有该位点的4种引物各1 μL。反应条件为95 ℃变性10 min；同样温度下1 min为1个循环，共计30或32个循环；退火时间为1 min，温度分别为64 ℃(OGG1 Ser326Cys)，60 ℃(APE1 Asp148Glu)，58 ℃(APE1 -141T/G)与66 ℃(XRCC1 Arg399Gln)；最后72 ℃下延长1 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后观察条带，判读基因型。

1.2.3基因测序所有样本完成PCR扩增后，将30例扩增产物送上海Sangon进行测序。

2结果

图1A为OGG1 Ser326Cys琼脂糖电泳结果。结果发现在3个位置都出现了条带，最上的条带位于446 bp处，可称为条带1；中间的条带位置在252 bp处，为条带2；而最末条带位于194 bp处，称为条带3。第1、2、5、6、7条带5个标本条带1、2、3皆有，提示为C/G型杂合产物，而第3、4标本只有条带1和3，提示为GG纯合型，第8个标本只有条带1和2，则为CC纯合型。图1B、图1C和图1 D是其余3个基因的琼脂糖电泳结果。根据图1B可知第1、2、7、8、9条带5个标本为条带1和条带2，判定为GG纯合型；第3个标本为条带1和条带3，判定为TT纯合型；第4、5、6条带3个标本均有，判读为T/G杂合型。图1C、D的判读方法相同，图1C提示第1、2和6个标本为TT纯合型，第5和7标本为GG纯合型，剩余为T/G杂合型；图1D提示第1、4和5号标本为GG纯合型，第3号标本为AA纯合型，其余标本为G/A杂合型。

L1400433标本同4个位点的测序分析结果，根据比对发现，PCR-CTPP结果与测序结果完全一致，证实实验结果准确可靠，见图2。

A:OGG1 Ser326Cys；B:APE1 Asp148Glu；C:APE1-141T/G;D:XRCC1 Arg399Gln。

图14个位点琼脂糖电泳结果

图2　4个SNP位点的测序结果

3讨论

PCR-CTPP是由Hamajima等在2001年提出，它的设计原理是采用等位基因特异的两对引物进行PCR扩增。对于一个SNP位点的X或Y碱基而言，X等位基因的一个引物(如1R反义引物)被设计为在3′端包含X′，即X等位基因的反义核苷酸；而它的对向引物(1F正向引物)则位于其上游a个bp的位置。同样，Y等位基因的正义引物包含Y等位基因，其反义引物位于其下游b个bp的位置。其中两个扩增片段的长短(a和b)必须有足够大的区分度，以便于在琼脂糖凝胶电泳的过程中能够分离条带并便于读取。在这种设计下，另有一段长度为c的片段(由1F和2R扩增得到)，c的长度为a与b之和去掉由1R和2F扩增得到的片段长度，是整个产物中最长的片段[10]。经过多年应用中的不断改良[9,11]，PCR-CTPP方法迄今已完成多种基因SNP位点的基因分型[12]。

既往采用的SNP分型方法包括直接测序、Taqman探针和PCR-RFLP法。前两种方法是通过直接读取DNA序列而得到不同分型，而PRC-RFLP则与CTPP法类似，也是先通过PCR扩增目的基因的方式，不同的是前者采用特异性的限制性内切酶切割扩增产物，从而达到分型效果[13]。相对CTPP法而言，RFLP法由于酶切反应导致耗时较长，且由于限制性酶切引物的设计限制了其在同一块凝胶上同时观察多个SNP位点基因型的能力，因此限制了其在临床检测的广泛应用。而CTPP法的分型则是在PCR扩增过程中完成，因此能够弥补这两点不足。PCR退火阶段的温度对于形成特定的DNA片段十分重要，由于PCR-CTPP方法的4种引物存在于同一反应体系中，因此，4种引物的退火引物必须十分接近，以便在同一退火温度下进行反应。在本研究中所采用的4个基因的引物，其退火温度介于58～66 ℃，符合反应条件，在设定温度下能够使DNA片段顺利形成。

本研究发现，PCR产物中最长的片段与DNA的完整性有一定关联，浓度较低或保存较长时间的样本其片段亮度较浓度高、保存时间短的样本低，因此在未特殊设计阴阳性对照的条件时，可以参照这一片段情况进行判读。

本研究通过PCR-CTPP的方法，与基因测序进行比对，确定了采用成对引物体系对BER途径3个关键蛋白基因的4个SNP位点进行基因分型，得到的结果证实了PCR-CTPP方法是切实可行的。然而，由于这种方法的引物条件较为苛刻，综合反应体系成分较为复杂，且最终的判读依赖琼脂糖凝胶电泳的条带，因此对于这种技术的进一步优化仍需继续进行。

参考文献

[1]Czarny P,Pawlowska E,Bialkowska-Warzecha J,et al.Autophagy in DNA damage response[J].Int J Mol Sci,2015,16(2):2641-2662.

[2]Maynard S,Schurman SH,Harboe C,et al.Base excision repair of oxidative DNA damage and association with cancer and aging[J].Carcinogenesis,2009,30(1):2-10.

[3]Schwartz S.Clinical utility of single nucleotide polymorphism arrays[J].Clin Lab Med,2011,31(4):581-594.

[4]Carlton VE,Ireland JS,Useche F,et al.Functional single nucleotide polymorphism-based association studies[J].Hum Genomics,2006,2(6):391-402.

[5]Li Z,Guan W,Li MX,et al.Genetic polymorphism of DNA base-excision repair genes (APE1,OGG1 and XRCC1) and their correlation with risk of lung cancer in a Chinese population[J].Arch Med Res,2011,42(3):2262-2234.

[6]Canbay E,Cakmakoglu B,Zeybek U,et al.Association of APE1 and hOGG1 polymorphisms with colorectal cancer risk in a Turkish population[J].Curr Med Res Opin,2011,27(7):1295-1302.

[7]Jelonek K,Gdowicz-Klosok A,Pietrowska M,et al.Association between single-nucleotide polymorphisms of selected genes involved in the response to DNA damage and risk of colon,head and neck,and breast cancers in a Polish population[J].J Appl Genet,2010,51(3):343-352.

[8]Zhang R,Zhu Z,Zhu H,et al.SNP Cutter:a comprehensive tool for SNP PCR-RFLP assay design[J].Nucleic Acids Res,2005,33(Web Server Issue):W489-492.

[9]Yang CH,Cheng YH,Chuang LY,et al.Confronting two-pair primer design for enzymefree SNP genotyping based on a genetic algorithm[J].BMC Bioinformatics,2010,11(509):11.

[10]Hamajima N.PCR-CTPP:a new genotyping technique in the era of genetic epidemiology[J].Expert Rev Mol Diagn,2001,1(1):119-123.

[11]Yin G,Mitsuda Y,Ezaki T,et al.A new PCR method:one primer amplification of PCR-CTPP products[J].Mol Biotechnol,2012,52(2):180-183.

[12]Maruyama C,Suemizu H,Tamamushi S,et al.Genotyping the mouse severe combined immunodeficiency mutation using the polymerase chain reaction with confronting two-pair primers (PCR-CTPP)[J].Exp Anim,2002,51(4):391-393.

[13]Bazakos C,Dulger AO,Uncu AT,et al.A SNP-based PCR-RFLP capillary electrophoresis analysis for the identification of the varietal origin of olive oils[J].Food Chem,2012,134(4):2411-2418.

The role of polymerase chain reaction with confronting two-pair primers in SNP genotyping of DNA base excision repair genes

Peng Yang,Cheng Yi,Yang Yuxin,Li Chongyi,Li Mengxia,Zhang Shiheng,Wang Dong△

(CancerResearchCenterofFieldSurgeryInstitute,theAffiliatedDapingHospitalofThirdMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

[Abstract]ObjectiveIt is important to precisely determinate the single nucleotide polymorphisms (SNPs) in many genes including genes related with base excision repair (BER) pathway.This research is conducted to evaluate the role of polymerase chain reaction with confronting two-pair primers (PCR-CTPP) in analyzing the SNPs of BER pathway.MethodsFour common SNPs of BER pathway (OGG1 Ser326Cys,XRCC1 Arg399Gln,APE1 Asp148Glu and -141T/G in the promoter region) was detected with PCR-CTPP.10 of the products were sent for genotype sequencing.Compare the results of PCR and sequencing to evaluate the accuracy of PCR-CTPP.ResultsThe genotypes were exactly the same as the sequencing.ConclusionThe PCR-CTPP was a reliable and rapid detective technology for SNPs genotyping.Its broadest application would be great help for gene variant analysis.

[Key words]polymorphism,single nucleotide;polymerase chain reaction with confronting two-pair primers;base excision repair

作者简介：彭杨(1988-)，本科，主要从事DNA分离与基因检测研究。△通讯作者，Tel:(023)68757151；E-mail:dongwang64@hotmail.com。

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.021

[中图分类号]Q786

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)16-2226-03

(收稿日期：2015-12-22修回日期：2016-03-01)