长链非编码RNA LOC100288637在原发性肝癌中差异性表达的生物学意义及相关机制研究*

王宇洲，许建华，常伟华，付航玮，皮儒先，陈　健，陈　平

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所,重庆 400042)



长链非编码RNA LOC100288637在原发性肝癌中差异性表达的生物学意义及相关机制研究*

王宇洲，许建华，常伟华，付航玮，皮儒先，陈健，陈平△

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所,重庆 400042)

[摘要]目的研究长链非编码RNA(LncRNA) LOC100288637在肝癌中的表达差异，对肝癌细胞增殖的影响及相关机制。方法分析GEO数据集GSE58043和GSE10694，得出LOC100288637及hsa-miR-101-3p在肝癌组织中差异表达，RNA-hybrid分析LOC100288637与hsa-miR-101-3p的结合具有可能性。逆转录-聚合酶链式反应在组织和细胞水平检测LOC100288637表达量。荧光原位杂交观察LOC100288637在细胞中的定位。敲低LOC100288637后CCK-8检测细胞增殖情况。过表达hsa-miR-101-3p后，检测LOC100288637的变化。结果LOC100288637在肝癌组织中的表达量高于癌旁组织 (P<0.05)；LOC100288637在肝癌细胞系中的表达量高于肝细胞系(P<0.05)。LOC100288637在HepG2细胞核质均有表达，以细胞质居多。敲低LOC100288637后HepG2细胞增殖活性降低(P<0.01)。过表达hsa-miR-101-3p后，LOC100288637表达量下降(P<0.05)。结论LncRNA LOC100288637可能在肝癌发生，发展过程中起重要作用并接受hsa-miR-101-3p靶向调控影响肝癌细胞的增殖。

[关键词]肝肿瘤；增殖；LOC100288637；101-3p

肝细胞肝癌(hepatocelluer carcinoma，HCC)，是常见的恶性肿瘤，具有较高的病死率，预后较差[1-2]。目前，手术治疗及化学治疗仍为肝癌治疗的主要手段，而肝癌患者的预后很大程度上取决于诊断、治疗的时期及个体差异[3-4]。非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)根据其长度，可分为长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)及非编码微小RNA(microRNA，miRNA)等[5]。在人类LncRNA占据非编码RNA的大多数，目前的研究表明它可以在不同水平调控细胞活动，既可以在转录水平调节基因的转录，也可以在转录后对蛋白质的修饰等进行调控，它可以促进或抑制基因的转录，也可以调节相应蛋白质的功能[6-10]。已有研究表明,LncRNA的失调与肝癌，以及其他肿瘤的发生、发展有密切关系。例如NEAT1在肝癌组织中高表达，并且NEAT1对临床上肝癌的发生、发展有促进作用，包括癌结节的数目、肝癌的TNM分级、肝癌的转移以及门静脉癌栓的形成[11]；BRAF-activated non-coding RNA (BANCR)能够对胃癌的发生、发展起到促进的作用等[12]。到目前为止，仍有大量未经研究的LncRNA可能与原发性肝细胞肝癌的发生、发展有密切关系。因此，为了更加深入地发掘肝癌发生发展的分子机制，针对与肝癌有关的LncRNA的研究具有重要意义。本研究通过对美国国立生物技术信息中心(NCBI)GEO数据库的数据集GSE58043、GSE10694进行分析，明确LncRNA LOC100288637，miRNA 101-3p在肝癌组织和癌旁组织中存在差异性表达，通过RNA-hybrid进行生物信息学分析得出LOC100288637与hsa-miR-101-3p的结合具有可能性[13],并在组织学及细胞学水平明确LOC100288637在肝癌发生、发展中的意义，以及受到hsa-miR-101-3p的靶向调控。

1材料与方法

1.1材料选取2015年3月至2015年6月，本院行手术切除并经病理确诊的10例原发性肝癌的肝癌组织及配对癌旁组织样本，所有病例术前均未行化疗、放疗及免疫治疗，癌旁组织取自上述癌组织切缘3 cm之外，样本获取后立即将样本浸入RNAfixer并保存于-80 ℃冰箱中。人类肝癌细胞系(HepG2、Huh7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Bel-7704)和人类正常肝细胞系(LO2)均保存于本科，该原始细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。主要试剂及材料：培养基、血清、胰酶、青霉素及链霉素均购自重庆卡尔波生物技术有限公司；引物为上海生物工程有限公司合成；转染试剂脂质体2000及Trizol试剂 购自Invitrogen (美国)公司；cDNA第一联合成试剂盒及实时荧光定量PCR(RT-PCR)试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；siRNA、mimics、Exiqon miRCURY LNA LncRNA 原位杂交探针、缓冲液等购自苏州瑞博生物技术有限公司； Cell Counting Kit (CCK-8)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，其他试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1生物信息学分析于NCBI的GEO数据库获得数据集GSE58043(含7对肝癌及癌旁组织的部分LncRNA芯片)和数据集GSE10694(含78对肝癌及癌旁组织，以及10例正常肝组织的部分miRNA芯片)，使用R语言进行基因差异性分析。使用RNA-hybrid预测LOC100288637与hsa-miR-101-3p的相互作用位点。

1.2.2细胞培养向75 cm2培养瓶中加入DMEM高糖培养基、胎牛血清(占总培养基10%)、50 U/mL青霉素和50 U/mL链霉素，分别接种HepG2、Huh7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Bel-7704及LO2细胞，于恒温培养箱中培养(37 ℃、5% CO2)。

1.2.3总RNA 抽提、逆转录及RT-PCR 反应用Trizol 试剂提取细胞及组织总RNA(方法按说明书步骤)，紫外分光光度计测定其纯度及浓度。根据Themo说明逆转录合成cDNA 的第一链。以合成的cDNA 为模版,扩增LOC100288637和GAPDH基因。LOC100288637引物序列：上游引物为5′-TCC TTT CCC CGC TGT TCT AAT TG-3′，下游引物为5′-TGA GAC CAC AGC GCC TGA GAA C-3′；GAPDH作为内参，其上游引物为5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物为5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。RT-PCR反应体系为20 μL，反应条件94 ℃预变性2 min,94 ℃变性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸15 s,共45个循环。以LOC100288637产物的荧光强度比上GAPDH 扩增产物的荧光强度的相对量代表LOC100288637的相对表达情况。每个实验重复3 次。以水为模板扩增的反应作为PCR 扩增的阴性对照。

1.2.4荧光原位杂交(FISH)取生长状态良好并处在对数生长期的HepG2细胞，于24孔培养板中置入10 mm×10 mm玻片，按照每孔5×103细胞密度接种于24空板中，24 h后去除上清，4%多聚甲醛固定后，0.1%Triton X-100通透，预杂交液37 ℃预杂交，LOC100288637探针 42 ℃杂交16～20 h。然后用2×SSC冲洗，滴加DAPI于切片杂交区域，10 min，PBS清洗后在荧光显微镜下观察。

1.2.5siRNA-LOC100288637干扰实验取生长状态良好并处在对数生长期的HepG2细胞，按照每孔5×103细胞密度接种于6孔板中，培养24 h。将HepG2细胞分为2组，即对照组及siRNA-LOC100288637干扰组，待细胞贴壁后，按脂质体2000 的说明书操作，混匀脂质体2000和LOC100288637 的siRNA，室温放置20 min后，将其滴入培养有HepG2 的培养板中，混匀培养，对照组将脂质体2000空载体滴入培养有HepG2 的培养板中。培养4～6 h后换为含血清的培养基。48 h后RT-PCR检测siRNA 的干扰效率。LOC100288637的siRNA序列为序列1：正义链5′-CCA CUA GUA UAC UAU UAA AUU-3′，反义链5′-UUU AAU AGU AUA CUA GUG GGG-3′；序列2：正义链5′-GGA CGU AUA UGC UGU GUA AAG-3′，反义链5′-UUA CAC AGC AUA UAC GUC CCU-3′；序列3：正义链5′-GGU CAC UAU AAC AAA UAU AAU-3′，反义链5′-UAU AUU UGU UAU AGU GAC CUG-3′。

1.2.6CCK8细胞增殖实验调整HepG2细胞密度接种于96孔板，每孔种约3×103个细胞，设对照组和实验组，每组设6个复孔，置于细胞培养箱中培养，24 h后转染。对照组加入脂质体2000空载体，实验组转染LOC100288637的siRNA。分别于转染12、24 h后从培养箱取出加入CCK8试剂，每孔100 μL培养液中加入10 μL CCK8试剂，置于细胞培养箱中培养1 h后取出，使用酶标仪测定450 nm处各孔吸光度(A)值，以反映细胞数目。

1.2.7has-miR-101-3p模拟物转染取生长状态良好并处在对数生长期的HepG2细胞，按2×104细胞密度接种于6孔板中，培养24 h，将HepG2细胞分为2组，即对照组和has-miR-101-3p模拟物组，待细胞贴壁后，按脂质体2000 的说明书操作，混匀脂质体2000和has-miR-101-3p模拟物，室温放置20 min后，将其滴入培养有HepG2 的培养皿中，混匀培养，对照组将脂质体2000空载体滴入培养有HepG2 的培养皿中。培养4～6 h后换为含血清的培养基。24 h后RT-PCR 检测LOC100288637的表达量。has-miR-101-3p模拟物序列：正义链5′-UAC AGU ACU GUG AUA ACU GAA-3′，反义链5′-CAG UUA UCA CAG UAC UGU AUU-3′。

2结果

2.1生物信息学分析结果本研究表明，LOC100288637，has-miR-101-3p在肝癌组织及配对癌旁组织中存在差异性表达，且两者有相互作用位点。对GEO数据库的数据集GSE58043、GSE10694进行分析，7对肝癌组织及癌旁组织的差异基因表达分析，LOC100288627在肝癌组织中呈高表达，在癌旁组织中低表达。78对肝癌组织及癌旁组织的差异基因表达分析显示，has-miR-101-3p在肝癌组织中呈低表达，在癌旁组织中高表达。通过RNA-hybrid进行生物信息学分析得出LOC100288637与hsa-miR-101-3p的结合具有可能性，且明确了两者的结合空间结构及结合位点。

2.2LOC100288637在肝癌组织及肝癌细胞系中高表达运用逆转录PCR检测手术切除的10 例肝癌组织和配对癌旁组织，以及5种肝癌细胞株和一种正常肝细胞株中LOC100288637的表达量(图1)，LOC100288637在临床患者的肝癌组织和癌旁组织中的相对表达量分别为1.80±1.35、0.53±0.34，LOC100288637在临床患者的肝癌组织中的表达量高于癌旁组织中表达量，两组比较差异有统计学意义(t=22.94，P<0.05)；LOC100288637在肝癌细胞系(HepG2、Huh7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Bel-7704)中的相对表达量分别为0.88±0.05、1.34±0.17、0.85±0.07、1.00±0.17、0.58±0.04，在正常肝细胞系(LO2)中的相对表达量为0.10±0.01，LOC100288637在5组肝癌细胞系中的表达量均明显高于在肝细胞系LO2中的表达量，5组肝癌细胞系分别与LO2细胞系比较，差异有统计学意义(t=24.47、12.56、18.41、9.08、18.38，P<0.05)，见图1。

2.3FISH检测结果FISH证实LOC100288637在胞质及胞核中均有分布，以胞质中的分布居多。使用LOC100288637探针对HepG2细胞株进行原位杂交，滴加荧光染料后，荧光显微镜下观察，见图2。

2.4向HepG2细胞转染siRNA能有效干扰LOC100288637的表达应用脂质体2000 介导的方法向HepG2细胞转染LOC100288637的siRNA，RT-PCR检测转染后细胞内LOC100288637的表达量，LOC100288637-siRNA组和LOC100288637-对照组的LOC100288637表达量分别为5.12±0.15,38.97±3.98,LOC100288637-siRNA组的LOC100288637表达量低于LOC100288637-对照组，两组比较，差异有统计学意义(t=14.72，P<0.01)，见图3。

2.5敲低LOC100288637能有效抑制HepG2细胞增殖使用siRNA敲低LOC100288637后，CCK8细胞增殖实验检测细胞的增殖活性。LOC100288637-siRNA组的细胞增殖活性明显低于LOC100288637-对照组，差异有统计学意义(F=139.80、191.40，P<0.01)，见图4。

A：LOC100288637在HepG2、Huh7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Bel-7704及LO2中表达水平;B：LOC100288637在10个患者组织标本中肝癌及癌旁表达水平。

图1RT-PCR检测LOC100288637在细胞系中

表达水平及患者组织标本中表达量

图2　荧光原位杂交检测LOC100288637在HepG2细胞中的分布

图3　LOC100288637的干扰序列(siRNA)能有效降低

图4　LOC100288637的干扰序列(siRNA)能有效

2.6hsa-miR-101-3p能够抑制LOC100288637表达用脂质体2000向HePG2肝癌细胞转染hsa-miR-101-3p的模拟物，RT-PCR检测转染后LOC100288637的表达量。miR-101-3p mimics组和miR-101-3p 对照组的LOC100288637表达量分别为0.08±0.00，1.00±0.05，miR-101-3p mimics组的LOC100288637表达量低于miR-101-3p对照组，差异有统计学意义(t=29.48，P<0.05)，见图5。

图5　hsa-miR-101-3p能有效抑制LOC100288637的表达

3讨论

肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，对于人类健康造成严重威胁，目前人们对肝癌的发病机制尚未完全了解[1-4]，手术切除仍然是目前最主要的治疗方式，但是手术后复发和转移仍然影响患者的长期生存，因此，为了寻找对于肝癌的其他的诊断及治疗方式，探索肝癌发生、发展的分子机制已成为目前的一个研究重点。

LncRNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA 分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA 的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平。尽管LncRNA曾被认为是转录“噪音”，但近年来在临床及细胞实验等多方面对于LncRNA的深入研究表明LncRNA是一种具有多种生物学功能的非编码RNA，它在细胞增殖、细胞周期、细胞分化、细胞凋亡，以及肿瘤的发生、发展等方面都具有非常重要的作用[6-10]。

近年来针对LncRNA对肝癌发生、发展的影响方面的研究已成为目前研究肝癌分子机制的一个热点，已有一些研究表明多种LncRNA可能与肝癌的发生、发展有密切关系，例如Yu等[14]发现Metallothionein 1D,Pseudogene (MT1DP)能够通过抑制FoxA1的蛋白合成负向调控AFP，抑制肝癌细胞的增殖并且促进肝癌细胞凋亡。Huang等[15]发现INK4基因座中反义非编码RNA(ANRIL)在HCC组织中高表达，在体内和体外实验中敲低ANRIL均可以抑制肝癌细胞的增殖并且可以促进肝癌细胞凋亡。更重要的是，一些LncRNA已经被公认为癌症诊断及治疗的靶点，比如通过检测H19、HOTAIR等可以肝癌、胃癌、乳腺癌等的诊断提供帮助。这些经研究证实对肿瘤发生、发展有重要作用的LncRNA都有一个共同特点，即在肿瘤组织和正常组织中存在差异性表达，而这一点对进行有关LncRNA和肿瘤的研究具有重要的指导作用。

在本研究中，通过对GEO数据库的数据集GSE58043和数据集GSE10694进行分析，得出LncRNARNA LOC100288637在肝癌组织中高表达，而miRNA-101-3p在肝癌组织中低表达的趋势，因此考虑LOC100288637可能与肝癌的发生、发展有密切关系，并且不排除has-miR-101-3p与LOC100288637存在联系。进一步通过序列比对预测分析(RNA-hybrid)，明确has-miR-101-3p和LOC100288637的结合空间结构及结合位点，为两者间存在作用关系找到了理论依据。通过RT-PCR检测LOC100288637表达量，发现LOC100288637在肝癌组织及肝癌细胞中高表达，而相应的癌旁组织及正常肝细胞则低表达该LncRNA，从细胞和组织学水平证实了LOC100288637的差异性表达。荧光原位杂交实验进一步验证了LOC100288637在肝癌细胞中表达，其主要分布于细胞质中。通过使用siRNA干扰LOC100288637的表达，HepG2肝癌细胞的增殖能力明显降低，说明LOC100288637能调控肝癌细胞的增殖。向HepG2肝癌细胞转染has-miR-101-3p的模拟物，上调has-miR-101-3p后，LOC100288637的表达量明显下降，说明has-miR-101-3p能调控LOC100288637的表达。

综上所述，LncRNA LOC100288637在肝癌的发生、发展中发挥着重要的作用，且受到has-miR-101-3p的调控；LncRNA LOC100288637可能可以作为肝癌治疗的一个潜在生物标学靶点。但LncRNA LOC100288637在肝癌侵袭转移及肿瘤干细胞相关方面是否存在一定的作用，课题组尚在研究之中。

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Research on the biological significance of the LncRNA LOC100288637 expression differences in primary hepatic carcinoma and the related mechanism*

Wang Yuzhou,Xu Jianhua,Chang Weihua,Fu Hangwei,Pi Ruxian,Chen Jian,Chen Ping△

(FieldSurgeryResearchInstitute,theAffiliatedDapingHospitaloftheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression differences of long noncoding RNA(LncRNA) LOC100288637 in liver cancer,the effect of LOC100288637 on liver cancer cell proliferation and the relevant mechanisms.MethodsBased on the analysis of the GEO database data sets GSE58043 and GSE10694,we found that both LOC100288637 and hsa-miR-101-3p has obvious expression differences in liver cancer tissues.RNA hybrid revealed the possibility of combination between LOC100288637 and hsa-miR-101-3p;RT-PCR was performed to measure the expression level of LOC100288637 in tissues and cells;fluorescence in situ hybridization was used to observe LOC100288637 localization in cells;cell proliferation was determined by CCK8 experiment after LOC100288637 siRNA knock down.The expression of LOC100288637 in cells were measured after treated with hsa-miR-101-3p mimics.ResultsRelative quantitative expression of LOC100288637 in liver cancer tissues group was significantly higher than that in no tumor tissues group (P<0.05);relative quantitative expression of LOC100288637 in liver cancer cell lines were significantly higher than that in normal liver cell line(P<0.05).LOC100288637 was located in both cytoplasm and nucleus of HepG2 cells,and mainly in cytoplasm.Cell proliferation vitality of HepG2 reduced after treated with LOC100288637-siRNA(P<0.01).Relative quantitative expression of LOC100288637 in HepG2 reduced after treated with hsa-miR-101-3p mimics(P<0.05).ConclusionLncRNA LOC100288637 may play an important role in liver cancer development,it can be down regulated by hsa-miR-101-3p and affect the proliferation of liver cancer cells.

[Key words]liver neoplasms;proliferation；LOC100288637;miRNA-101-3p

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.012

*基金项目:国家自然科学基金面上项目(81270523)。

作者简介：王宇洲(1989-)，医师，硕士，主要从事肝癌及肝再生方面研究。△通讯作者,Tel:13708349071；E-mail:chenping@263.net。

[中图分类号]R394.2；R73-35；R735.7

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)18-2198-04

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-03-06)