阿尔茨海默病大鼠模型建立及葛根素对大鼠空间学习记忆的影响*

李　冬，田　寅，宫　宇，王　曦

(佳木斯大学附属第一医院：1.药剂科；2.肿瘤外科,黑龙江佳木斯 154007)



阿尔茨海默病大鼠模型建立及葛根素对大鼠空间学习记忆的影响*

李冬1，田寅2△，宫宇1，王曦1

(佳木斯大学附属第一医院：1.药剂科；2.肿瘤外科,黑龙江佳木斯 154007)

[摘要]目的探讨葛根素对β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)诱导的阿尔茨海默病(AD)大鼠空间学习记忆障碍的影响。方法采用双侧海马注射Aβ1-42诱导AD大鼠模型。造模后3 d起，葛根素按不同剂量灌胃给药28 d，给药结束后采用Morris水迷宫测试系统，检测大鼠空间学习记忆能力。结果模型组大鼠表现出明显的学习记忆能力障碍，而葛根素高、中、低剂量组干预则显著地改善了AD大鼠学习记忆能力。结论葛根素能部分的提高AD模型大鼠的空间学习记忆能力。

[关键词]阿尔茨海默病；葛根素；空间学习记忆

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种起病隐匿的中枢神经系统退行性疾病，其主要临床表现为严重的不可逆转、渐进性的认知功能障碍和精神异常[1-2]。AD发病初期，会出现近期记忆出现缺失，保存远期的记忆和高级学习记忆[3-4]。之后，记忆缺失进展为远期记忆及其他认知和行为功能缺失，认知功能下降、进行技巧工作及理解力损害、语言和视空间反常，计算能力下降[5-7]。本研究以逃避潜伏期和过台次数为指标，通过Morris水迷宫检测葛根素对AD大鼠空间学习记忆的影响，为AD的研究提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与分组将成年健康雄性SD大鼠60只，体质量180～220 g(佳木斯大学实验动物中心)分为6组，即假手术组、模型对照组、盐酸多奈哌齐对照组、葛根素低剂量组、葛根素中剂量组、葛根素高剂量组，每组各10只。

1.1.2实验仪器脑立体定位仪(江湾一型C，第二军医大学)；微量进样器(上海精密激光仪器厂)；电子天平(AE-240型，梅特勒-托利多仪器有限公司)；超低温冰箱(MDF-492，日本三洋公司)；电冰箱(BCD-243型，中国康拜恩电冰箱总厂)；压力蒸汽灭菌器(ZDX-35SB，上海申安医疗器械厂)； PURELAB PLUS超纯水系统(美国波尔公司)；电热恒温鼓风干燥箱(101-1AB，天津泰思特仪器有限公司)。

1.1.3药品及试剂葛根素纯粉剂(南京正大天晴制药有限公司)；盐酸多诺哌齐片(贵州圣济堂制药)；Aβ1-42(Sigma公司)；无水乙醇注射液(天津市凯通化学试剂有限公司)。

1.2方法

1.2.1AD大鼠模型的建立[8]大鼠适应性饲养7 d，术前12 h禁食不禁水，进行造模。SD大鼠经戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于江湾Ⅰ型C大鼠立体定位仪，颅顶区备皮，消毒，沿头顶中线部位作约2 cm的切口，将骨膜分离使其头骨暴露，从前卤向后约3.0 mm，从中线左、右两旁开2.0 mm处，将用牙科钻打开颅骨。用微量进样器垂直进针2.8 mm，将10 μg/μL β-淀粉样蛋白Ⅰ(Aβ1-42)溶液在5 min内缓慢注入，留针5 min后缓慢撤针，再用牙科泥封堵住颅骨，消毒并缝合皮肤。假手术组注射与1 μL 0.9%生理盐水注射液，其余操作同前。以假手术组平均逃避潜伏期作为参考值，用每支大鼠的逃避潜伏期与参考值只差占该大鼠的逃避潜伏期的比值来判定判定AD大鼠模型的建立是否成功，该比值大于20认为造模成功，造模不成功的大鼠不列入数据计算。

1.2.2动物给药治疗动物造模3 d后开始灌胃给药治疗。葛根素低、中、高剂量组分别按25、50、100 mg/kg给药，盐酸多奈哌齐对照组用盐酸多奈哌齐溶液灌胃治疗(按0.33 mg/kg给药)，假手术组与模型对照组用相同体积的0.9%氯化钠注射液灌胃治疗，共给药28 d。

1.2.3Morris水迷宫测试[9]预先在水池里注入清水，水温控制在26 ℃左右，加入奶粉使其成为不透明的乳白色水溶液，再将适量的清水注入，使水面略高于平台，水深在30 cm左右。实验开始前1 d将大鼠分别放入没有平台的水迷宫内，每只鼠

表1　定位航行实验各组大鼠平均逃避潜伏期±s，s)

*：P<0.05，与模型组比较。

自由游泳2 min，使其适应游泳环境，将大鼠头部染成黑色。实验历时7 d，每次训练限时1 min。测试开始时沿水池中部的池壁将大鼠缓慢的放入池中，大鼠需面对池壁入水。记录大鼠从入水点入水后在1 min内找到平台的时间，若大鼠在1 min内没能找到平台，就人工把大鼠置于平台上并使其在上面停留30 s，结束1次训练。实验过程中水池周围的参照物位置保持不变。连续实验6 d，实验的第7天，撤掉安全平台开始测试大鼠对平台空间位置记忆的能力。与前6 d测试步骤相同，记录大鼠寻找记忆中的平台所花费的时间。将大鼠第1次经过平台的时间(潜伏期)和每只大鼠在1 min内经过平台的次数分别记录。

2结果

2.1定位航行实验结果定位航行实验结果显示，在6 d的实验中，各组大鼠的平均逃避潜伏期总体呈下降趋势，说明大鼠经过多次训练，对平台的记忆能力增加，但是各组大鼠的学习记忆能力有所不同。采用重复测量多因素方差分析结果显示：在不同时间大鼠逃避潜伏期差异有统计学意义[F(5，105)=141.225，P<0.05]，以时间为主效应，差异有统计学意义[F(25，525)=3 921.016，P<0.05]。各时间点和不同组别之间存在交互效应[F(30，535)=12.806，P<0.05]。表明模型组大鼠学习获取能力较差，而葛根素能改善模型大鼠的学习障碍。比较不同时间段各指数之间的差异，第1天各组大鼠逃避潜伏期无明显差异，第2～6天，模型组大鼠平均逃避潜伏期较假手术组明显延长(P<0.05)；葛根素组和盐酸多奈哌齐组大鼠平均逃避潜伏期较模型组明显缩短(P<0.05)，见表1。

2.2空间探索实验结果在空间探索实验中，与假手术组比较，模型组跨越原平台的次数明显减少，而葛根素低剂量、中剂量、高剂量组大鼠跨越原平台的次数明显增多。盐酸多奈哌齐与葛根素效应相当，见表2。

表2　各组大鼠跨越原平台的次数比较±s)

*：P<0.05，与模型组比较。

3讨论

迷宫是检测大鼠空间学习记忆能力的装置，本研究先对动物进行某种训练，经过一定的时间后，测其保存量以衡量其记忆。游出时间及错误次数反映了动物的学习记忆能力。实验中，经过反复训练动物，同时记录动物寻找平台的时间来评价其学习能力，动物寻找平台的时间越短，说明动物学习能力越强。撤掉平台后，通过检测动物经过原平台所在位置的次数来评价动物对于训练的记忆能力。给药结束后，将6组实验动物分别进行训练和测试，增加训练的次数，各组平均寻找平台的时间呈逐渐缩短趋势。这表明大鼠通过多次训练，寻找平台的能力增加。但Aβ1-42注射所致AD大鼠模型组学习记忆能力明显低于假手术组，表明脑内注射Aβ1-42制备的动物模型记忆能力明显的下降，动物具有类似“痴呆”表现，表明AD模型制备成功。而葛根素组与多奈哌齐组的潜伏期明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。表明葛根素和多奈哌齐对Aβ1-42诱导的AD大鼠模型的学习记忆缺失具有明显的改善功能。实验结果还显示，葛根素组对AD大鼠学习记忆能力的改善作用与假手术组相比还具有一定的差距，表明葛根素只能部分的提高AD模型大鼠的学习记忆能力，却不能彻底的治愈。

参考文献

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[2]刘祥琴,刘小琦,晏宁.老年性痴呆患者血浆NO和H2S的变化及意义[J].重庆医学,2012,41(1):19-21.

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[9]王海燕,王影,聂磊,等.左乙拉西坦对癫痛大鼠认知功能及海马组织中NPY和NCAM-mRNA表达的影响.[J].黑龙江医药科学,2013,36(3):3-5.

The construction of Alzheimer′s disease rats model and the effects of puerarin on rat spatial learning and memory*

Li Dong1,Tian Yin1△,Gong Yu2,Wang Xi1

(1.DepartmentofPharmacy;2.DepartmentofSurgicalOncology,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi,Heilongjiang154002,China)

[Abstract]ObjectiveTo research the effects of puerarin on Alzheimer′s disease(AD) rats spatial learning and memory disorder induced by Aβ1-42.MethodsBilateral hippocampal injection of Aβ1-42 was used to induced AD model rats.All rats underwent gavage administration with puerarin with different dose for 28 d since the 3rd day after the construction of model;and the Morris water maze was used to test the spatial learning and memory ability of rats.ResultsThe model group rats showed obvious learning and memory disorder,and the ability of learning and memory disorder of rats in the high,medium and low dose of puerarin intervention group were significantly improved.ConclusionPuerarin can improve the spatial learning and memory ability of AD model rats.

[Key words]Alzheimer disease;puerarin;spatial learning and memory

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.007

*基金项目：佳木斯大学青年基金项目(Sq2013-021)。

作者简介：李冬(1982-)，主管药师,硕士，主要从事临床药学、天然药化研究。△通讯作者,Tel:15694549965；E-mail:dongdong_3333@163.com。

[中图分类号]R965.2

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)16-2180-02

(收稿日期：2015-12-25修回日期：2016-03-01)