超声波预处理对双酶法提取酒糟中蛋白质的影响

张丙云，裴芳霞，任海伟，马文鹏（.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050；.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉8300）



超声波预处理对双酶法提取酒糟中蛋白质的影响

张丙云1，裴芳霞1，任海伟1，马文鹏2
（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050；2.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉831100）

摘要：为提高酒糟中蛋白质的提取率，研究了超声波预处理对双酶法提取蛋白质的影响。以蛋白质提取率为指标，筛选适宜酒糟蛋白质提取的酶解方案，通过响应面设计考察超声波预处理对蛋白质提取率的影响并优化预处理参数。结果表明，单种酶辅助提取时，添加纤维素酶的蛋白质提取率高于木聚糖酶。与单种酶辅助提取相比，纤维素酶和木聚糖酶2种酶同步添加的双酶法提取效果最好。双酶同步提取蛋白质的适宜条件为：纤维素酶和木聚糖酶的添加质量分数分别是3%和4%，酶提取时间4.5 h，该条件下蛋白质提取率为30.25%。响应面优化后的超声波预处理条件为：料液比1∶17、超声波时间38 min和超声波功率480 W，超声波预处理后的蛋白质提取率升至43.37%。超声波预处理能有效提高酒糟蛋白质的酶法提取率。

关键词：酒糟；纤维素酶；木聚糖酶；超声波预处理；蛋白质提取

优先数字出版时间：2016-02-02；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1602.009.html。

中国是白酒消费和生产大国，每年产生大量的废弃酒糟，转化利用不足极易造成环境污染和资源浪费。目前，酒糟的再利用途径主要包括生产有机肥、发酵饲料、食用菌、燃料棒、活性炭和食醋等［1-2］。本课题组利用生化方法将酒糟转化为可发酵糖后发酵制备了木糖醇、乙醇和乳酸等［3-5］。另一方面，酒糟中蛋白质含量为12%～18%，饲用价值较高，但酿酒过程添加的稻壳中含有植酸，会影响动物对酒糟蛋白的消化吸收，而且酒糟中的蛋白质被纤维木质素类物质包裹，不易被释到细胞外，难被生物利用，导致饲用品质下降［6］。为进一步提高酒糟蛋白质的饲用价值，应设法将其提取利用。

目前，常用的蛋白质提取法有化学法（如醇碱法［7-8］、碱法［9］、溶剂法［10］）、生物法（如酶法［11］）和物理辅助提取法（如粉碎、超声波、微波、球磨等［12］）。其中，化学法易引起蛋白质变性和环境污染，酶法则多使用水解蛋白酶类，导致蛋白被水解成肽，造成蛋白损失。研究表明，纤维素酶等碳水化合物酶也可以提高蛋白质提取率，该方法在米糠蛋白提取中已得到应用［13］，但未见在酒糟蛋白提取中应用的报道。同样，超声波作为一种物理辅助提取方法也能有效提高蛋白质提取得率［14］。

鉴此，以白酒糟为原料，针对其致密网络结构和木质纤维素含量高等特点，拟采用纤维素酶和木聚糖酶等碳水化合物酶辅助进行蛋白质提取，着重比较单种酶、双酶分步或同步的酶法提取蛋白方案，并考察超声波预处理对蛋白提取率的影响，以期为酒糟蛋白质的提取奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

耗材：白酒糟（以干基计，蛋白质含量为12.74%），甘肃金徽酒股份有限公司；纤维素酶（滤纸酶活10万U/g，厂家推荐最适pH4.8，温度为50℃），宁夏和氏璧生物技术有限公司；木聚糖酶（滤纸酶活5万U/g，厂家推荐最适pH5.0，温度为50℃），宁夏和氏璧生物技术有限公司；3，5-二硝基水杨酸等试剂均为分析纯。

仪器设备：HH-4数显恒温水浴锅，北京国华电器有限公司；GZX-924MBE数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KH-600DE数控超声波清洗机，昆山禾创超声仪器有限公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1酶法提取酒糟中蛋白质的方案筛选

为确定纤维素酶和木聚糖酶的适宜加酶量和酶解时间，首先进行单种酶辅助提取实验。分别考察酶添加量（1%、2%、3%、4%和5%）和酶提取时间（纤维素酶：1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h；木聚糖酶：1.5 h、2 h、2.5 h、3 h和3.5 h）对蛋白质提取率的影响，在此基础上按照表1中酶解顺序进行双酶组合提取实验。

表1　酶添加顺序组合方案设计

具体方法为：准确称取5 g酒糟样品，以1∶10（w/v）料液比加入pH4.8的柠檬酸缓冲液，依次进行单种酶提取和双酶组合提取实验，50℃恒温提取一定时间，沸水浴灭酶，快速冷却后以4000 r/min离心10 min，所得上清液定容至50 mL，采用凯氏定氮法测定其蛋白质浓度并按公式（1）计算提取率：

1.2.2超声波预处理条件的优化

分别选取超声波时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）、超声波功率（100 W、200 W、300 W、400 W、500 W、600 W）和料液比（1∶8 g/mL、1∶10 g/mL、1∶12 g/mL、1∶14 g/mL、1∶16 g/mL、1∶18 g/mL）3个因素进行超声波预处理，预处理后的酒糟在1.2.1中确定的适宜酶解条件下提取蛋白质，步骤与计算方法同1.2.1。在单因素结果基础上，利用Box-Benhnken中心组合实验设计原理，以蛋白质提取率为评价指标进行超声波预处理参数的响应面优化，见表2。

表2　因素水平表

2结果与分析

2.1单种酶辅助提取蛋白质的研究筛选

2.1.1酶添加量对蛋白质提取率的影响

由图1可知，随着纤维素酶和木聚糖酶添加量的增加，蛋白质提取率呈先增加后降低的趋势，纤维素酶在添加量3%时，提取率最高达28.34%；木聚糖酶在添加量4%时，提取率达到最高值26.43%。另一方面，相同酶添加量条件下，添加纤维素酶的蛋白提取率始终高于木聚糖酶，这是因为酒糟原料中纤维素含量较多，且木质纤维结构最易受到纤维素酶的作用，使得蛋白质提取率升高；而半纤维素是木质纤维结构的粘合剂，被纤维素和木质素等组分包埋，只有在木质纤维网络结构疏松后才能被木聚糖酶作用。故添加纤维素酶的提取率高于木聚糖酶［15］。纤维素酶的添加量确定为3%，木聚糖酶的添加量确定为4%。

图1　　加酶量对蛋白质提取率的影响

2.1.2酶提取时间对蛋白质提取率的影响

由图2可知，随着提取时间的延长，蛋白质提取率呈先上升后下降的趋势，纤维素酶作用2.5 h时的蛋白质提取率最高，为25.16%，而木聚糖酶在提取2 h后达到最高值25.80%。可见，适当延长提取时间有利于蛋白质提取。因为反应初始阶段的底物浓度较高，酶与底物接触较充分，酶作用时间越长，木质纤维结构越松散，蛋白质越易溶出。但时间过长会因木质素组分对纤维素酶和木聚糖酶产生的吸附作用而导致蛋白质提取率下降。因为酒糟的木质纤维素底物上有很多孔洞，相当数量的孔洞尺寸与酶分子直径相近。酶一旦进入孔洞，就很难游离到水解液中［16］。故纤维素酶和木聚糖酶的酶解时间分别确定为2.5 h和2 h。

图2　　酶提取时间对蛋白质提取率的影响

2.2酶添加方案对蛋白质提取率的影响

由图3可知，与单种酶辅助提取蛋白质相比，双酶分步或同步添加的组合法均能有效提高蛋白质提取率，且同步添加纤维素酶和木聚糖酶时的蛋白质提取率最高，达到30.24%，说明纤维素酶和木聚糖酶协同作用可将原料中纤维素和木聚糖切成短链寡聚糖，有利于切断多糖基质中的连接，释放出更多的蛋白质［17］。故确定纤维素酶和木聚糖酶同步添加为适宜酒糟蛋白质提取的酶解方案。

图3　酶添加方式对蛋白质提取率的影响

2.3超声波预处理对蛋白质提取率的影响

2.3.1超声波时间对蛋白质提取率的影响

固定超声波功率300 W，料液比1∶10，研究超声波时间对蛋白质提取率的影响。由图4可知，随着超声波时间的延长，蛋白质提取率呈先上升后下降的趋势，并且超声波处理40 min时蛋白质提取率达到最高值43.95%。因为超声波作用时能产生热效应、机械效应和空化效应等［17］，能加速木质纤维结构的破坏与瓦解，促进蛋白质提取。但随着超声波时间的延长，产生的热量过多易导致蛋白质稳定性降低，使溶出的蛋白质变性或沉淀［18］，故超声波预处理时间设置为40 min。

图4　超声波时间对蛋白质提取率的影响

2.3.2超声波功率对蛋白质提取率的影响

固定料液比1∶10，超声时间40 min，研究超声波功率对蛋白质提取率的影响。由图5可知，随着超声波功率的增大，蛋白质提取率逐渐增加，但功率高于500 W时增加趋势放缓。因为随着超声波功率的提高，振动空化等作用使原料木质纤维网络结构变疏松，有利于酶分子渗透进入和蛋白质的溶出。当功率超过500 W时，超声波热效应瞬间增强，容易使蛋白质变性，反而不利于其提取溶出［17］，故初步选择超声波功率为500 W。

22.3.3料液比对蛋白质提取率的影响

图5　超声波功率对蛋白质提取率的影响

固定超声波功率300 W，超声波时间40 min，研究料液比对蛋白质提取率的影响。由图6可知，随着料液比的减小，蛋白质提取率先上升后下降，当料液比为1∶16时，提取率达最高值43.31%。因为当料液比较高时，体系浓度和黏度值较高，酶解反应的传热传质进程易受高黏度影响；而液体体积的增加可以降低体系黏度，增加传质过程，同时增大了酶和底物的接触机率，有利于蛋白质溶出。当料液比达到一定值后会使溶液浓度过小，超声波产生的机械作用不能均匀地作用于底物，使提取率降低［17］，故初步选取料液比为1∶16。

图6　料液比对蛋白质提取率的影响

2.4响应面分析与优化

根据2.3中单因素实验结果，采用Box-Behnken设计对超声波预处理参数进行优化。实验方案及结果见表3。

表3　响应面法设计及其实验结果

根据表3实验结果，对响应值（蛋白质提取率）进行回归分析，回归拟合得到蛋白质提取率与3个因素的回归方程：Y=41.82+0.18*A+0.18*B-0.38*C-0.12*A*B+ 2.5*A*C+0.12*B*C+0.63*A2+0.99*B2+0.15*C2。

回归方程的方差分析结果如表4所示，结果表明该模型P＜0.001极显著；失拟项P=0.2813＞0.05，差异不显著，说明残差由随机误差引起。方程一次项中A和C（固液比）是极显著因素，B是显著因素，方程二次项中A2和B2是显著因素。AC交互相显著，表明实验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项与响应值有很大关系。在所选取的各因素水平范围内，根据F值大小可知影响因素的主次顺序为超声波功率＞料液比＞超声波时间。该模型的相关系数R2为0.971，R2Adj为0.933，因此回归方程具有相当高的拟合度。信噪比S/N为12.636，远大于4.0，说明模型的可信度很高，故该模型可用于超声波预处理参数的理论预测［19］。

表4　回归模型方差分析

2.4.1响应面分析各因素对蛋白质得率的影响及优化结果

等高线的形状可反映出交互效应的强弱，2个因素的交互作用越强，等高线越接近椭圆，而圆形则表示交互作用不明显，并且等高线越密集表明该因素的影响效果越大［20］。由图7可知，超声波功率固定在零水平时，蛋白质提取率随料液比和超声波时间的增加呈先增加后降低的趋势，并且料液比的响应面曲面较超声波时间陡，表明料液比较超声波时间影响大，二者等高线接近圆形，说明超声时间和料液比交互作用不明显。当超声波时间固定在零水平时，随着超声波功率的增加，蛋白质的提取率呈逐渐增加的趋势，而料液比减小使蛋白质的提取率先增加后降低。当料液比固定在零水平时，蛋白质提取率随时间的延长先提高后降低。前期提取率增加的原因是超声波一旦与体系组分接触，会立即产生机械效应和空化效应，原料木质纤维网络结构被破坏，从而使蛋白质分子的溶出能力增强。而超声时间和超声功率增加到一定值时，蛋白质的某些次级键受到破坏而变性，从而使得蛋白质的溶解度下降［21］。

2.4.2最佳预处理条件的确定及实验验证

经Design-Expert 8.0分析，可得超声波预处理的最佳条件为：料液比为1∶17.256（w/v）、超声时间为38.16 min、超声功率为485.78 W，该条件下蛋白质预测提取率为44.26%。为了验证此模型的可靠性和实用性，且考虑实际操作可行性，将上述工艺条件修正为料液比1∶17、超声波时间38 min、超声波功率480 W。该条件下进行平行实验3次，得到酒糟蛋白质提取率的平均值为43.37%，与预测值接近，表明此模型对优化超声波提取参数是可行的。

3　结论

3.1纤维素酶和木聚糖酶的双酶法同步辅助提取酒糟蛋白质的适宜条件为：纤维素酶和木聚糖酶的添加量分别为3%和4%，酶提取时间4.5 h，该条件下的蛋白质提取率为30.25%。

图7　因素交互作用对蛋白质提取率影响的响应曲面

3.2响应面法优化后的超声波预处理最优参数为：料液比为1∶17、超声波时间为38 min、超声波功率为480 W，经超声波预处理后，双酶法辅助提取蛋白质的提取率达到43.37%。

3.3超声波预处理有利于纤维素酶和木聚糖酶同步提取酒糟中的蛋白质，具体机理还需进一步研究。

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中图分类号：TS262.3；TS261.9；X797

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）05-0099-05

基金项目：甘肃省自然科学基金项目（148RJZA015）；新疆维吾尔自治区高校科研计划项目青年教师科研培育基金（XJEDU2014S086）。

收稿日期：2015-12-23

作者简介：张丙云（1968-），女，副教授，硕士，研究方向为食品科学。

通讯作者：任海伟（1983-），男，副教授，研究方向为食品加工副产物综合利用，E-mail：rhw52571119@163.com。

Effects of Ultrasonic Pretreatment on Protein Extraction from Distillers Grains by Dual-Enzymatic Method

ZHANG Bingyun1，PEI Fangxia1，REN Haiwei1and MAWenpeng2
（1. School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou，Gansu 730050；2. Xinjiang Agricultural Vocational Technical College，Changji，Xinjiang 831100，China）

Abstract：In order to increase the extraction rate of proteins from distillers grains，the effects of ultrasonic pretreatment on protein extraction by dual-enzymatic method were investigated. Protein extraction rate was used as the index to screen out the best enzymatic hydrolysis programs for protein extraction. Besides，ultrasonic pretreatment parameters were optimized by response surface method. The results showed that，protein extraction rate by cellulase-assisted extraction was higher than that by xylanase-assisted extraction，and dual-enzymatic extraction（synchronous addition of both cellulase and xylanase）was superior to single-enzymatic extraction. The optimum dual-enzymatic extraction conditions were summed up as follows：the adding levels of cellulase and xylanase were 3%and 4%respectively，and enzymatic extraction time was 4.5 h. Under these conditions，protein extraction rate was 30.25%. The optimum ultrasonic pretreatment conditions were determined as follows：solid-liquid ratio was 1∶17（g/L），ultrasonic time was 38 min，and ultrasonic power was 480 W. Protein extraction rate increased to 43.37%after ultrasonic pretreatment. In conclusion，ultrasonic pretreatment could effectively increase protein extraction rate.

Key words：distillers grains；cellulose；xylanase；ultrasonic pretreatment；protein extraction